miR-185-3p影响破骨细胞形成*

付应霄，毛颖基，牛德群，黄银久

(1.蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠医学院第二附属医院)

人体骨量的维持有赖于破骨细胞(osteoclast)主导的骨骼吸收过程以及成骨细胞(osteoblast)主导的骨骼形成过程[1]。机体骨骼吸收异常加剧则易导致其总量流失过度，进而可能引发骨质疏松症、Paget’s，类风湿性关节炎等溶骨性疾病[2]。骨骼吸收的速率一定程度上取决于破骨细胞的数量与蚀骨功能，然而其数量与蚀骨功能受多种复杂因素的调节，因此，确定相关因素及其作用机理显得尤为关键。

microRNAs能够调控破骨细胞分化与活性[3]，但该领域研究尚待深入。笔者前期通过miRNA表达谱分析(由中国上海KangChen Bio-tech完成)发现，与破骨细胞前体相比较，分化破骨细胞内miR-185-3p 表达水平上调极显著(P<0.01)，此结果提示，miR-185-3p可能影响破骨细胞的分化过程，本研究将系统研究miR-185-3p对破骨细胞形成的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1RAW264.7细胞株 购自中科院细胞库(上海生命科学研究院)。

1.1.2主要试剂 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)与MEM-α (Minimum essential medium α)细胞培养基、胎牛血清(GE Healthcare，美国)；M-CSF(Macrophage colony stimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子)、RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，核因子 kappa-B 活化因子配基) (PeproTech，美国)；TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶)染色试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)；COAS(Corning Osteo Assay Surface)吸收活性分析多孔培养板；miRNA-185-3p引物、U6引物、All-in-One miRNA qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)检测试剂盒(GeneCopoeia，美国)；Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen Corporation，美国)。

1.2方法

1.2.1破骨细胞诱导培养 复苏RAW264.7细胞并培养于DMEM培养基 (含10 % FBS、青霉素+链霉素)。取对数生长期RAW264.7细胞重悬于MEM-α培养液 (含10 % FBS、青霉素+链霉素)，并接种至细胞培养板。培养4 h，待细胞贴壁换含25 ng/mL M-CSF + 100 ng/mL RANKL的MEM-α培养液 (含10 %FBS、青霉素+链霉素)，继续培养，隔天换液。

1.2.2RNA提取与miR-185-3p表达水平检测 培养结束，收集RAW264.7细胞与M-CSF + RANKL联合诱导培养RAW264.7细胞(已分化细胞)，提取总RNA。测定并调整RNA浓度，运用All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒进行逆转录获取cDNA，并通过实时荧光定量PCR法检测RAW264.7细胞与诱导分化细胞内miRNA-185-3p表达水平。

1.2.3miR-185-3p 模拟物(mimics)与阻遏物转染(inhibitors) RAW264.7细胞接种并贴壁生长，运用Lipofectamine 2000 将miR-185-3p 模拟物与阻遏物转染RAW264.7细胞，6 h后更换含M-CSF + RANKL的MEM-α培养液。

1.2.4TRAP染色及计数 实验设置miR-185-3p 模拟物与阻遏物转染的M-CSF + RANKL诱导组与M-CSF + RANKL诱导组。培养结束吸弃培养基，采用4 %多聚甲醛溶液固定细胞，10 min后弃去固定液，超纯水清洗样品，弃尽残液，加入预配染色液，37 ℃染色50-60 min。染色结束，倒置显微镜观察、拍照并计数≥3个核的破骨细胞。

1.2.5吸收活性检测 实验设置miR-185-3p 模拟物与阻遏物转染的M-CSF + RANKL诱导组与M-CSF + RANKL诱导组。细胞接种于COAS培养板，培养结束。取COAS培养板，弃培养基，超纯水冲洗孔底。加入10 %次氯酸溶液，室温放置5 min。超纯水冲洗，自然晾干后倒置显微镜观察吸收陷窝，并计算面积。

2 结果

2.1miR-185-3p表达水平变化 实时荧光定量PCR法检测结果表明，M-CSF + RANKL诱导分化细胞内miRNA-185-3p表达水平显著高于RAW264.7细胞(P<0.05)。该结果与前期miRNA表达谱分析实验结果相符。见图1，表1。

表1 分化破骨细胞与破骨细胞前体差异表达miRNA(mmu-miR-185-3p)

2.2miR-185-3p 影响破骨细胞分化形成 对各组细胞进行TRAP染色，结果可见分化形成的多核细胞体积大、铺展明显、胞质呈现酒红色、胞核无色(图2A)。细胞计数表明，与M-CSF+RANKL联合诱导组(8.67±1.70)相比较，miR-185-3p模拟物转染组(12.33±1.27)破骨细胞数量显著增多(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物转染组(3.67±0.61)破骨细胞数量极显著减少(P<0.01)(图2B)。

2.3miR-185-3p 影响破骨细胞吸收活性 统计表明，miR-185-3p模拟物转染组吸收陷窝面积(96 058.99±29 837.22)μm2显著大于M-CSF+RANKL组的(34 985.92±13 440.78)μm2(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物转染组(2 997.89±947.90)μm2则显著小于M-CSF+RANKL组(P<0.05)。见图3。

3 讨论

破骨细胞形成与功能的关键鉴定指标是其分化形态与吸收活性[1]。本文发现miR-185-3p模拟物转染组破骨细胞数量显著增多吸收活性增强，而miR-185-3p阻遏物转染组破骨细胞数量极显著减少且吸收活性减弱。表明，miR-185-3p 能够促进破骨细胞的分化形成。

Dgcr8(DGCR8, DiGeorge syndrome critical region gene 8)，Dicer和Ago2(Argonaute 2)是miRNAs维持稳态和发挥功能的关键因素。通过小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)沉默破骨细胞前体中Dgcr8, Dicer, 或者Ago2基因，结果发现，破骨细胞的分化形成和功能均受到显著影响。在miRNA缺陷的破骨细胞前体呈现出破骨细胞分化和活化的关键转录因子如PU.1，Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)，Fos和Nfatc1(nuclear factor of activated T cells)等表达水平下调的现象，表明miRNAs能够影响破骨细胞的形成与活性[4]。

多种miRNAs可能通过调控破骨细胞分化与活化过程的靶基因或相应信号转导途径，进而影响破骨细胞的形成或功能。如hsa-miR-422a、hsa-miR-148a-3p、miR-31-5p、miR-29、miR-183-5p、miR-214-3p等可促进破骨细胞的分化和活化；而miR-26a-5p、miR-34a-5p、miR-124-3p、miR-125a-5p、miR-503-5p等则抑制破骨细胞的分化和活化；另外，miR-223-3p、hsa-miR-133a-3p、miR-21-5p等对破骨细胞的分化和活化兼具促进和抑制双重影响[5]。但绝大部分miRNAs对破骨细胞分化与活化的调控机制仍亟待确定。

miR-185-3p是近年来新发现的miRNA，已有报道多集中于miR-185-3p影响肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等行为[6-7]。此外，miR-185-3p亦可参与细胞自噬的调控[8]。但尚无miR-185-3p调控破骨细胞分化与活化的相关报道。

笔者通过生物信息学方法，对mmu-miR-185-3p潜在靶基因进行预测，取miRWalk，miRanda，RNA22，Targetscan四个软件预测结果交集，发现TRAF3为mmu-miR-185-3p的潜在靶基因之一。报道表明，TRAF 3能够阻抑RANKL诱导的破骨细胞分化形成过程[9]。RANKL通过TRAF 2/cIAP 1/2诱导TRAF 3发生泛素化和溶酶体降解，释放NIK以磷酸化激活IKK-α，引起蛋白酶体将p100加工成为p52。RelB：p52异二聚体进入细胞核诱导相关靶基因表达。TNF不降解TRAF 3，从而导致NIK被降解，导致破骨细胞前体细胞质中p100的积累，从而限制破骨细胞前体的分化[10]。

本文发现，miR-185-3p 可促进破骨细胞分化，推测其可能通过靶向调控破骨细胞前体的TRAF3基因(破骨细胞分化的负调控基因)，进而影响该细胞的形成，详细机理尚待进一步研究。