LC-MS/MS 法同时快速检测牛肉中12 种β- 受体激动剂的应用研究

β- 受体激动剂，俗称瘦肉精，不是某一种特定的药物，而是一类药物，能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长。当它们以超过治疗剂量5-10 倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”，促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。[1-3]

但瘦肉精用量大、作用的时间长、代谢慢，所以在屠宰前到上市，在动物体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐地中毒，如果一次摄入量过大，就会出现异常的生理反应，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉类后会出现头晕、恶心、手脚颤抖、心跳加速甚至心脏骤停致昏迷死亡，特别对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害。[4-7]

在中国，通常所说的“瘦肉精” 则是指盐酸克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。其它类似药物还有沙丁胺醇和特布他林等，都因为对人体健康危害过大，造成安全隐患，而在全球遭到禁用。在2001 年12 月27 日、2002 年2 月9 日、4 月9 日，农业部分别下发文件禁止食品动物使用β- 受体激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176 号、193 号公告、1519 号条例）[8-12]。

因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长，瘦肉精让猪、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，带来更多经济价值，国内养殖户不顾农业部的规定，在饲料中掺入过量瘦肉精，给市场上的肉类食品带来了严重的安全隐患，所以研究出科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

目前常用的β- 受体激动剂检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法（GC/MS）、酶联免疫法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）。其中HPLC 法灵敏度较低，不能满足痕量检测要求[13-15]；GC/MS 法除了需要大量的前处理步骤，还要求进行衍生化操作，较为繁琐；ELISA 法虽然操作简单，但极容易出现假阳性情况，定性结果的准确性较差；只有LC/MS/MS 法具有高效的分离能力和准确的定性定量能力，被广泛使用，但此法也因为复杂耗时的前处理而被诟病[16]。因此建立一种科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

材料与方法

仪器与试剂

仪器名称：NexeraX2 超高效液相色谱和8045 电喷雾三重四级杆质谱仪（日本岛津）、ULPHW-I 超纯水机（上海优普）、MTN-2800W 氮吹浓缩仪（德国AUTO Science公司）、超声波清洗机（昆山洁力美）、H1850R 冷冻离心机（湘仪仪器）、TG16-WS 高速离心机（湘仪仪器）、VM-D 涡旋混合器（上海皓庄仪器）、JY2002 百分之一电子天平（舜守恒平仪器）、肉类绞碎机（嘉厨食品机械）、ATX224 万分之一电子天平（日本岛津）；仪器经校准检定合格后方可使用。

标准溶液名称：实验所用β- 受体激动剂类标准品： 盐 酸 克 伦 特 罗（Clenbuterol）、 莱 克 多 巴 胺 (Racto pamine）、 沙 丁 胺 醇（Salbutamol）、 特 布 他林（Terbutaline）、 西 马 特 罗(Cimaterol)、 氯 丙 那 林（Clorprenaline）、 溴 布 特 罗(Brombuterol)、 齐 帕特 罗 (Zilpaterol)、 喷 布 特 罗（Penbutolol)、 马 布 特 罗（Mabuterol)、 妥 布 特 罗（Tulobuterol)、 非 诺 特 罗（Fenoterol）采购于曼哈格公司。

同位素内标克伦特罗-D9 (Clenbuterol-D9）、莱 克 多 巴 胺-D3 (Ractopamine-D3）、 沙 丁 胺醇-D3(Salbutero1-D3），购于Dr .Ehrenstorfer 公司。

实验试剂与耗材：乙腈（上海安谱公司，色谱纯）、甲醇（上海安谱，色谱纯）、乙酸（山东西亚，色谱纯）、甲酸（山东西亚，色谱纯）、无水硫酸镁（国药集团，分析纯）、无水硫酸钠（国药集团，分析纯）、乙酸铵（国药集团，分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（国药集团，分析纯）、C18 填料( 天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、PSA 填料( 天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、GCB 填料( 天津博纳艾杰尔)，粒径40-60μm；

方法

实验色谱和质谱条件

色谱条件为：色谱柱： C18色谱柱， 规格2.1×100mm，粒径1.9μm；柱温：32℃；进样体积：2μL；流速：0.3mL/min；流动相A 是体积浓度为0.1% 甲酸水溶液，流动相B为0.1% 甲酸水溶液[17]，洗脱梯度，洗脱条件见表1；所述初始流动相是体积比为9:1 的0.1% 甲酸水溶液和乙腈的混合液；

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质谱条件为： 雾化气流速：3.0L/min； 干燥气流速：10.0L/min； 加 热 气 流 速：10.0L/min；DL 管 温 度250℃[18]；加热气温度：350℃；接口电压：4000V；离子源类型：电喷正离子模式；扫描方式：多反应监测扫描；氦气作为碰撞气，雾化气和加热气均为氮气，干燥气为洁净空气，各个物质及内标物的主要质谱参数见表2:

标准溶液的制备

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混合标准工作溶液：分别称取10mg 的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗、氯丙那林、溴布特罗、齐帕特罗、喷布特罗、马布特罗、妥布特罗、非诺特罗12 种β- 受体激动剂，用甲醇溶解并定容至100mL, 此贮备液浓度为100mg/L，得到混合标准贮备液，用0.1% 甲酸水- 乙腈（9:1）来稀释混合标准贮备液，配制混合标准工作溶液，浓度梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每个浓度梯度中均加入有6ng 的同位素内标物, 同位素内标物由质量比为1:1:1 的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3 和沙丁胺醇-D3 组成。

混合内标标准工作溶液：分别称取10mg 的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3 和沙丁胺醇-D3 三种β- 受体激动剂内标物质, 用甲醇溶解并定容至100mL, 此贮备液浓度为100mg/L，得到混合内标标准贮备液，用0.1% 甲酸水溶液稀释混合内标标准贮备液，配制混合内标标准工作溶液，使其浓度都相当于50ng/mL。

混合标准贮备液和混合内标标准贮备液需保存在-20℃冰箱中冷冻，有效期一年；混合标准工作溶液和混合内标标准工作溶液需保存在4℃冰箱中冷藏，有效期一周。

混合提取剂的制备

混合提取剂是体积比为2:1:9 的0.25mol/L 乙酸铵水溶液、0.1mol/L 乙二胺四乙酸二钠水溶液和1.5% 甲酸乙腈溶液的混合液；所述0.25mol/L 乙酸铵水溶液用乙酸调节pH 值为5.2[19]。

混合除水试剂的制备

混合除水试剂由质量比为3:1 的无水硫酸镁和无水硫酸钠组成。

混合净化试剂的制备

混合净化试剂由500mg 无水硫酸镁，75mg N- 丙基乙二胺,100mg 十八烷基键合硅胶,25mg 石墨化碳黑组成[20]。

样品溶液的制备

购买牛肉实验样品8 份（每份不少于500g），对市面上购买的实验样品（不少于500g）进行绞碎处理，并充分混匀样品，称取5.0g 绞碎后的牛肉样品，向猪肉样品加入120μL 混合内标标准工作溶液和12mL 混合提取剂，旋涡混匀1min，超声处理20min 后，加入4.0g 混合除水试剂，混匀，10000rpm 离心3min，得到提取液；量取3mL 提取液于离心管，加入混合净化试剂，漩涡震荡30s，5000rpm离心1min 后，40℃水浴氮气吹至近干后，用1mL 初始流动相定容，经0.22μm 滤膜过滤，得到样品溶液。

上机检测

用液相色谱串联质谱仪检测样品溶液和混合标准工作溶液，并以β- 受体激动剂的质量浓度为横坐标，以β- 受体激动剂的峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算牛肉中β-受体激动剂的含量。

结果分析

标准溶液曲线图

12 种混合合标准工作溶液的图谱见图1；

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图1 12 种混合合标准工作溶液的图谱

1 沙丁胺醇、2 特布他林、3 西马特罗、4 莱克多巴胺、5 盐酸克伦特罗、6 氯丙那林、7 溴布特罗、8 齐帕特罗、9 喷布特罗、10 马布特罗、11 妥布特罗、12 非诺特罗

控制各个化合物质量浓度梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，以各个标准工作溶液的质量浓度X 为横坐标，以其标准品的峰面积Y 为纵坐标，绘制标准工作曲线。同时要控制待测样品的质量浓度在标准工作曲线的范围内。分析实验数据后得到12 种化合物的线性方程，相关系数，保留时间，和检测低限见表3：

8 份牛肉实验样品检测结果见表4：

经实验分析，在不同市场上购买的新鲜牛肉均未检出此方法中讲述的12 种β- 受体激动剂。

选取空白基质样品，使用上述前处理方法，仪器分析方法以及耗材和仪器对其进行了添加回收实验，添加量分别为0.5ng/mL，2.5ng/mL，7.5ng/mL，色谱图峰型良好，保留时间较稳定，能够满足检测需求，实验结果见下表5：

表5 可以看出， 本方法的添加回收率为85.37%-97.78%，RSD ≤11.6%，表明本方法可以保证检测结果的准确度和可重复性，可达到检测要求，满足猪肉中β- 受体激动剂的检测。

结果与讨论

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本实验建立一种同时快速检测牛肉中12 种β- 受体激动剂的LC-MS/MS 法。本方法中12 种β- 受体激动剂在质量浓度为0.1ng/mL～10.0ng/mL 范围内线性关系良好（R2 ≥99.85）， 添加回收率为85.37%-97.78%，RSD ≤11.6%。本方法检测准确度高、定性准确快捷、无需对样品衍生化处理、前处理时间短、减少基质干扰、检测时间短、同时减少有毒试剂的使用，值得推广使用。

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