瑞舒伐他汀抑制脑缺血再灌注损伤大鼠P-选择素表达的研究

陈子卿 许斐凡 王杰华 刘晓东 郑丁还 张志勇 陈奕虎

【摘要】 目的：探讨瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中P-选择素的抑制作用。方法：将36只大鼠随机分为三组，分别为假手术组、模型组和治疗组。除假手术组外，对其余大鼠复制脑缺血再灌注模型。治疗组在术前用瑞舒伐他汀连续灌胃10 d，假手术组和模型组正常喂养。模型组和治疗组于术后2 h拔出线栓形成再灌注。24 h后应用免疫组织化学法、RT-PCR法和Western blotting法检测三组脑组织中P-选择素的表达。结果：模型组P-选择素表达水平较假手术组明显上调（P<0.05）;治疗组P-选择素表达水平较模型组明显下调（P<0.05）。结论：瑞舒伐他汀可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后P-选择素的表达。

【关键词】 瑞舒伐他汀 脑缺血再灌注 P-选择素

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.13.003 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）13-000-03

Inhibiting Effect of Rosuvastatin on the Expression of P-selectin in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion/CHEN Ziqing， XU Feifan， WANG Jiehua， LIU Xiaodong， ZHENG Dinghuan， ZHANG Zhiyong， CHEN Yihu. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（13）： 7-9

[Abstract] Objective： To explore the inhibiting effect of Rosuvastatin on the expression of P-selectin in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion. Method： A total of 36 rats were randomly assigned into three groups， the sham operation group， the model group and the treatment group respectively. The model of cerebral ischemia-reperfusion was replicated in other rats except the sham operation group. Before making a model， the treatment group was lavaged with Rosuvastatin for 10 days continuously， and the sham operation group and the model group received normal feeding. In the model group and the treatment group， the thread was pulled out 2 hours after operation to form a reperfusion. The expression of P-selectin in the brain tissues of the three groups was detected by immunohistochemistry， RT-PCR and Western blotting after 24 hours. Result： The expression levels of P-selectin in the model group were significantly up-regulated compared with those of the sham operation group （P<0.05）. The expression levels of P-selectin in the treatment group were significantly down-regulated compared with those of the model group （P<0.05）. Conclusion： Rosuvastatin can inhibite the expression of P-selectin in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion.

[Key words] Rosuvastatin Cerebral ischemia-reperfusion P-selectin

First-authors address： Huian County Hospital， Huian 362000， China

腦缺血再灌注损伤后病理机制涉及众多生物活性因子和细胞内信号转导途径的参与，其中炎症反应起着重要作用[1]。脑缺血再灌注损伤后继发的炎性反应过程需要细胞黏附分子如P-选择素的参与，其介导了白细胞的浸润、黏附血管及穿过血管等过程[2]。瑞舒伐他汀作为一种传统的降脂药，具有改善内皮功能、抑制炎症反应、减少氧化应激等作用[3]。本课题主要观察大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中P-选择素的表达情况，并探讨瑞舒伐他汀对P-选择素表达的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料

研究时间为2017年6月-2019年3月，选取雄性SD大鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码：SCXK（沪）2012-0002]36只，体重250～300 g。随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组12只。

1.2 方法

1.2.1 实验准备 瑞舒伐他汀（英国阿斯利康制药公司，生产批号：KF059，规格：10 mg/片）;P-选择素兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物有限公司）;即用型免疫组化试剂盒、AEC试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）;Trizol试剂（美国Invitrogen公司）;PCR试剂盒、逆转录试剂盒（立陶宛MBI Fermentas公司）;PCR引物合成（上海生工生物工程技术公司）;β-actin和辣根酶标记IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）;Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）。

1.2.2 模型制作 治疗组在术前用瑞舒伐他汀连续灌胃10 d，剂量为5 mg/（kg·d），1次/d;其余两组术前给予同等剂量的生理盐水，1次/d，共10 d。模型组和治疗组复制脑缺血再灌注模型，采用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，使其仰卧固定于手术台上，于颈部正中做一切口，钝性分离鼓泡腺，将其上翻并加以保护。分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），结扎ECA和CCA近心端，于ICA内置一动脉夹，于CCA近分叉处剪一约0.2 mm侧“V”形切口，插入栓线，插入深度为（18.5±0.5）mm。使栓线进入ICA，越过大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）开口处，到达大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA）起始部，阻断MCA的所有血液来源，扎紧备线，甲状腺复位，关闭并缝合皮肤切口[4]。假手术组接受相似手术处理，但不插入线栓。术中，大鼠用小加热毯进行保温处理，保持肛温37 ℃。模型组和治疗组于术后2 h拔出线栓，形成再灌注。术后24 h后处死所有大鼠，取右侧大脑脑皮质备用。

1.2.3 免疫组织化学法检测P-选择素的表达 取脑皮质组织切片，采用免疫组化SP二步法染色，AEC法显色，苏木素复染。以光学显微镜视野（×400倍）观察组织切片，计算阳性细胞数。

1.2.4 RT-PCR法检测P-选择素mRNA的表达 P-选择素基因扩增产物大小345 bp、GADPH基因擴增产物大小210 bp。取脑皮质组织提取总RNA进行PCR扩增反应。结果以P-选择素与GADPH的吸光度比值代表基因表达相对水平。

1.2.5 Western blotting法检测P-选择素蛋白的表达 取脑皮质组织提取蛋白、浓度测定、变性、电泳、转膜封闭，依次进行一抗和二抗的抗原抗体反应，显色、X片显影、定影。结果以P-选择素与β-actin的灰度值比值代表蛋白表达相对水平。

1.3 观察指标

对比三组P-选择素表达情况。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 17.0软件统计，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

假手术组未见P-选择素表达。模型组P-选择素阳性血管数、mRNA和Western蛋白印迹表达水平均显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗组P-选择素阳性血管数、mRNA和Western蛋白印迹表达水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、图1、图2、图3。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤后往往伴随炎症反应的发生和发展。P-选择素作为炎症反应过程中的重要因子，可介导多形核细胞聚集并黏附于血管内皮上，加重脑组织微循环障碍[5]。P-选择素在生理情况下表达极少，但在血栓形成、炎性反应等病理过程中可发挥重要作用。临床研究显示，P-选择素表达水平在脑梗死患者中明显上升[6];基础研究显示，P-选择素可促进小鼠脑梗死面积的扩大，加重神经功能缺损[7]。本研究发现，模型组脑皮质中P-选择素的表达水平较假手术组显著升高（P<0.05），与以往报道一致，提示P-选择素在脑损伤的病理过程中具有重要作用，可在一定程度上反映急性脑缺血损伤的严重程度。有研究表明，通过对P-选择素水平进行动态检测有利于诊断早期急性脑梗死患者类型，可为临床采取相应的诊疗措施以防止病情恶化提供参考，从而降低患者的致残率和病死率[8]。

他汀类药物为临床常用降脂药，具有显著的抗动脉粥样硬化作用。除此之外，他汀类药物还具有抗炎、抑制细胞凋亡、抑制血小板聚集等多重效应[9-10]。瑞舒伐他汀作为强效调脂药，相对其他降脂药而言，具有更好的安全性和耐受性。笔者在以往的基础研究中发现，瑞舒伐他汀可通过调节缺血区脑组织炎性因子的水平而起到神经保护作用[11-12]。本实验中，通过对模型组和治疗组进行对比，进一步显示，治疗组脑皮质中P-选择素的表达水平较模型组下调（P<0.05），表明瑞舒伐他汀能够有效抑制P-选择素的表达，从而减轻炎症反应，发挥神经保护作用。

参考文献

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（收稿日期：2019-12-19） （本文编辑：李盈）