特应性皮炎与银屑病之间差异表达的微小RNA及其生物学功能▲

罗 浩 吴志洪 钟 江 张 衍 冯 杲

(广西中医药大学第一附属医院皮肤科，南宁市 530023，电子邮箱:luohao1943@163.com)

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)和银屑病是最常见的两种慢性炎症性皮肤病，虽然两者都是公认的遗传和免疫介导的皮肤病，但是导致皮肤炎症的确切机制尚未完全清楚。目前，高通量测序是研究疾病基因遗传学机制的热点之一。基于高通量平台的RNA测序允许同时比较数千个信使RNA，而在转录水平上微小RNA(microRNA,miRNA)可以靶向调控大量信使RNA，通过这种方式识别组织炎症反应的疾病特异性模式。Nomura等[1]对上述两种皮肤病皮损组织中12 000个基因进行检测，发现大多数基因在AD及银屑病中的表达相似；其中编码CC亚家族趋化因子的一组基因在AD中的表达明显增加，而编码CXC亚家族趋化因子的一组基因在银屑病皮损中的表达明显增加，而两者分别趋化辅助性T细胞(helper T cell,Th)1和Th2，浸润炎症细胞的差异性解释了AD与银屑病炎症反应类型的不同。然而目前还没有研究针对这两种炎症性皮肤病的复杂基因表达进行miRNA差异性分析。本研究采用高通量测序对AD和银屑病之间差异性表达的miRNA进行筛选，然后分析差异miRNA靶基因涉及的生物过程和信号通路，从而了解miRNA在这两种炎症性皮肤病中的作用机制，为这两种常见皮肤病的诊断和治疗提供新的方向。

1 资料和方法

1.1 高通量测序标本来源 选取2017年9月至2018年9月在我院皮肤科确诊的8例AD患者(AD组)和8例银屑病患者(银屑病组)为研究对象，其中AD患者符合Williams诊断标准[2]，银屑病组患者符合寻常型银屑病的诊断标准[3]。纳入标准：2个月内未使用抗组胺药物、类固醇皮质激素、免疫调节剂等药物。排除标准：合并心、脑、肺、肾脏器疾病及高血压等疾患。其中AD组男性4例、女性4例，年龄(26.5±10.6)岁；银屑病组男性5例、女性3例，年龄(32.2±8.4)岁。两组患者的性别构成、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者及家属了解研究详情并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 RNA保护液(ABI公司，批号:N8080119)，反转录试剂盒(Thermo公司，批号:15596-026)，Illumina TruSeq Small RNA Preparation试剂盒(Illumina公司，批号：RS-200-0036)，RNA连接酶(Thermo公司，批号：EL0021)，反转录试剂盒(Thermo公司，批号：K1691)，RNA酶(Thermo公司，批号：EN0601)，QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)试剂盒(QIAGEN公司，批号：208054)；荧光定量PCR仪(ABI公司，型号：7500)；分光光度计(Thermo公司，型号：BioMate160)。

1.3 高通量测序方法

1.3.1 标本获取：皮肤活检前均停用局部类固醇皮质激素或钙调磷酸酶抑制剂2周以上。选取患者四肢典型皮损，常规消毒皮肤后，行病理活检时留取直径3～4 mm组织，放入冻存管中，加入RNA保护液，液氮速冻后放入-80℃保存。

1.3.2 总RNA提取：取冻存的标本进行瞬时离心后，TRIzol一步法提取组织中总RNA，用分光光度计分析RNA浓度及纯度，琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量。

1.3.3 文库的构建与测序：利用Illumina TruSeq Small RNA Preparation试剂盒构建Illumina文库。(1)在 RNA连接酶(RNA与连接酶比例约为4 ∶1)的作用下加上3′端和5′端的碱基序列。(2)使用反转录试剂盒将RNA样本反转录为cDNA，加入RNA酶去除未反转录为cDNA的RNA，反应条件为37℃逆转录15 min，98℃ 5 min，使酶失活后置于冰上。(3)使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)试剂盒行PCR扩增。反应体系10 μL，包括2×浓缩的实时定量PCR预混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，荧光染料0.05 μL，模板cDNA 1 μL，无酶水2.95 μL。反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性2 s，60℃退火30 s，共40个循环。(4)采用Agilent 2100 Bioanalyzer检测miRNA的文库质量。用Illumina HiSeq 2500测序平台对该文库进行高通量测序。

1.3.4 测序数据分析和处理：筛选所有的原始测序序列，去除测序接头、低质量的碱基(碱基含2个以上的错配，单个碱基重复超过6个)和高通量测序读数(reads)，保留修剪后长度大于17nt的reads。使用FANSe3超高精度序列比对算法，将各样本测序得到的reads与人类基因组参考序列进行比对，筛选出已知miRNA序列并分类注释，根据RPKM值(每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数)来估算基因表达丰度；同时采用edgeR软件包进行差异基因分析，筛选差异miRNA时需从差异倍数(fold change,FC)和显著水平P值两个方面进行评估，本次分析中差异基因的筛选阈值设定为:|log2(FC)|>1且P<0.01。

1.4 实时荧光定量PCR验证

1.4.1 标本来源：另外选取同期于我院皮肤科就诊的AD、银屑病患者各3例，排除和纳入标准同1.1。AD组男性1例、女性2例，年龄(31.1±11.8)岁；银屑病组男性2例、女性1例，年龄(35.8±10.4)岁。选取在我院激光美容科切除的3份无病理改变皮肤组织作为正常对照组，分别来源于1例男性、2例女性，年龄(36.0±12.3)岁。3组研究对象的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有研究对象及家属均了解研究详情并签署了知情同意书。

1.4.2 引物设计： 为验证高通量测序的结果，选取上、下调表达差异显著的miRNA进行验证，在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中检索核苷酸序列，并用Primer 5.0引物设计软件设计保守区域的特异性上、下游引物，见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物基因序列

1.4.3 实时荧光定量PCR检测：采用TRIzol法提取组织的总RNA后，将其反转录为cDNA，均按照试剂盒说明书进行操作。使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)试剂盒行PCR扩增。反应体系10 μL，包括2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，荧光染料0.05 μL，模板cDNA 1 μL，无酶水2.95 μL。反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性2 s，60℃退火30 s，共40个循环。根据所得的Ct值，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算AD皮损组织miRNA相对于银屑病皮损组织miRNA的相对表达量。

1.5 生物信息学分析 应用 Human TargetScan(http://www.targetscan.org/) 、miRanda(http://www.miranda.org/)、miRBase(http://www.mirbase.org/)等软件对差异表达的miRNA进行靶基因预测。对获得的靶基因取交集后，采用分析软件topGO(version 2.18.0)对所有靶基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析，包括分子功能、生物过程、细胞组分3个方面。采用KOBAS软件进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以校正后P<0.05为显著性阈值得出GO高频率注释及基因集合富集的信号转导通路。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。正态分布计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验；计数资料以例数(百分比)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异表达miRNA的筛查结果 共筛选出204个差异表达的miRNA，其中168个表达上调，36个表达下调，见图1。显著上调的基因有hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-1-3p、hsa-miRNA-206、hsa-miRNA-133b、hsa-miRNA-133a-5p等，显著下调的基因有hsa-miRNA-122-5p、hsa-miRNA-199b-3p、hsa-miRNA-196a-5p等，见表2。

图1 两组样本差异表达miRNA火山图

表2 log2(FC)较大的miRNA

2.2 实时荧光定量PCR验证结果 根据测序结果，选取上调、下调差异显著的hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-199b-3p进行验证，结果归一化后提示，AD中hsa-miRNA-133a-3p相对表达量为(6.02±2.36)，与银屑病相比上调约5倍，hsa-miRNA-199b-3p相对表达量为(1.81±0.73)，与银屑病相比下调约2倍，与测序结果大致相符。

2.3 生物学分析结果 针对上下调差异表达miRNA进行靶基因预测，取交集后进行GO功能分析。 结果显示GO分析中预测的靶基因主要位于细胞器、细胞膜及细胞质等部位；分子功能主要富集在蛋白结合、离子结合、核酸结合、有机环状化合物结合、转移酶活性及催化活性等；生物学功能主要富集于生物调节、细胞代谢、有机物代谢、大分子的代谢及氮化合物代谢过程等。分别根据分子功能、生物功能、细胞组成3个部分的显著性差异基因个数分布情况，选取富集度最高的10条进行展示(见表3)。在GO注释分类的基础上进行KEGG信号通路富集，结果显示差异基因主要涉及代谢途径、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路、EB病毒感染、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、黏着斑、人类嗜T细胞病毒Ⅰ型(human T-lymphotropic virus Ⅰ,HTLV-Ⅰ)感染、癌症通路、癌症中的转录失调及轴突导向等，部分结果见表4。采用散点图对KEGG富集部分分析结果进行图形化展示，P值最小的20条通路条目见图2。

表3 差异表达miRNA预测靶基因的GO聚类分析

表4 差异基因KEGG代谢通路分析

图2 KEGG通路富集图

3 讨 论

miRNA是一类单链非编码RNA，通过与其靶基因mRNA分子的3′端非编码区互补结合，可以对基因组中的大部分基因进行转录后调节[4]。既往有研究对AD和银屑病两种皮肤病皮损组织中miRNA的表达进行分析[5-6]，然而目前尚无研究针对这两种炎症性皮肤病的复杂基因表达进行miRNA差异性对比分析。本研究采用高通量测序技术对AD和银屑病的miRNA进行分析筛选，比较两者的基因表达模式，发现与银屑病相比，AD有204个miRNA表达差异，包括168个表达上调的miRNA(hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-1-3p、hsa-miRNA-206、hsa-miRNA-133b、hsa-miRNA-133a-5p等)和36个表达下调的miRNA(hsa-miRNA-122-5p、hsa-miRNA-199b-3p、hsa-miRNA-196a-5p等)，进一步比较hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-199b-3p的验证结果与检测结果， 发现这两个基因的验证结果与检测结果具有较好的一致性，说明测序数据的可靠性。通过生物信息学筛选差异表达miRNA的靶基因并取交集后，进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，结果显示，AD与银屑病相比，差异靶基因多富集在蛋白结合、离子结合、生物调节、细胞代谢等分子功能和生物功能上，多涉及代谢途径、PI3K/Akt信号通路、EB病毒感染及MAPK信号通路等。

miRNA-133是细胞发育、增殖及心脏病和癌症发生的关键调控因子。miRNA-133在绝大部分肿瘤如胃癌、前列腺癌、结直肠癌中表达下调[7-8]，miRNA-133不仅能够使细胞周期停滞在G2-M期，还可抑制肿瘤细胞的增殖[9]。有学者发现miRNA-133a通过靶向调控Akt和MAPK通路，抑制结直肠癌及乳腺癌的增殖和转移[10-11]。miRNA-133还能通过靶基因白细胞介素1受体相关激酶负向调控Toll样受体信号通路，导致核因子κB转录激活，最终参与对炎症反应的控制[12]。在头颈部鳞癌和膀胱癌细胞系中，miRNA-133直接调控谷胱甘肽硫转移酶P1，而该酶通过与Toll样受体级联反应中的肿瘤坏死因子受体相关因子2同源分子相互作用，参与肿瘤坏死因子-α触发的信号激活[13]。CXC趋化因子受体4已被证实为人类miRNA-133的靶标，其通过控制G蛋白信号传导和PI3K/Akt信号传导途径与促炎反应相关[14]。以上研究均表明miRNA-133与PI3K/Akt信号通路、Toll样受体信号通路之间存在联系。既往已有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活参与银屑病的发病过程[15-16]。而PI3K/Akt通路激活后促进角质形成细胞过度增殖,抑制分化，并增加抗凋亡的核因子κB信号，不仅可以抵抗银屑病角质形成细胞的死亡[17]，还可以促进细胞因子表达导致炎症反应[18]。

miRNA-1、miRNA-133a/b和miRNA-206在鼻黏膜中广泛表达，其中循环中的miRNA-206和miRNA-133b表达水平被认为是过敏和哮喘状态的生物标志物[19]。而CD4+T淋巴细胞中miRNA-133b和miRNA-206的共表达被认为对Th17细胞具有特异性,而作为Th17型免疫反应的新型生物标志物[20]。在肺部疾病中，miRNA-1受到血管内皮生长因子抑制后导致内皮细胞Th2型炎症反应激活，促进活化T细胞的募集、嗜酸性炎症及Th2细胞因子的产生[21]。Th2型细胞因子白细胞介素13能够通过PI3K/Akt3与蛋白激酶C-d信号通路，平衡调控基质金属蛋白酶13的表达，从而参与组织重塑，减少胶原降解而诱导AD真皮增厚[22]。其他miRNA如miRNA-206、miRNA-125b、miRNA-29和miRNA-196a等也能通过调控胶原蛋白、整合素及基质金属蛋白酶的表达，在皮肤纤维化的发展中发挥作用[23-24]。

miRNA-199家族包括miRNA-199a和miRNA-199b，两者在结构上只相差几个碱基，呈高度同源。miRNA-199是在癌症中研究较多的一种miRNA，其已经被证明参与各种类型癌症的发生发展，包括髓母细胞瘤、绒毛膜癌、慢性髓细胞白血病、结直肠癌及肾细胞癌等[25-27]。然而，目前关于miRNA-199在皮肤疾病中的作用研究仍较少。Sonkoly等[28]采用微阵列技术进行研究，发现AD皮损中miRNA-199b表达下调。杨志波等[15]的研究表明，miRNA-199a能够抑制银屑病患者皮损中低氧诱导因子的表达，而低氧诱导因子能影响丙酮酸氢化酶的活性，从而导致糖代谢紊乱以及蛋白降解途径中断,进而影响血管增生及表皮细胞的增殖，从而参与银屑病的发病机制。此外，miRNA-199还监管脂肪细胞转录后基因的调节，在脂质代谢中具有重要作用。已有研究表明，高脂饮食可导致小鼠脂肪组织中miRNA-199a-3p表达降低，miRNA-199a-3p通过直接靶向硬脂酰辅酶a去饱和酶的3′-未翻译区来调节脂肪细胞的分化[18]。Gao等[29]也发现miRNA-199通过调节帕霉素激酶调控褐色脂肪的生成和产热能力，在抗肥胖及代谢紊乱性疾病中发挥作用。而miRNA-122与胆固醇稳态、脂肪酸代谢和脂肪生成也密切相关，研究结果显示，高脂肪喂养的小鼠体内沉默miRNA-122后脂肪酸合成与氧化的相关基因(如脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶1、乙酰辅酶A羧化酶2)发生了改变，肝脂肪变性减少[30-31]。由此可见，miRNA-199、miRNA-122等miRNA分子与脂质代谢通路之间密切相关。而有学者通过微阵列技术筛选出179个差异基因进行检测，发现脂质代谢相关基因与银屑病的关系最为密切[32]。

本研究获得的AD与银屑病之间差异表达的miRNA，如miRNA-203、miRNA-146a、miRNA-21和miRNA-125b等，都不是AD和银屑病中关注度较高的miRNA，大多数是在肿瘤、脂质代谢、炎症方面发挥作用；并且在AD和银屑病中出现上、下调控差异的miRNA的靶基因涉及细胞功能和信号通路有相同也有差异。这或为分析这两种炎症性皮肤病基因学差异，以及寻找有利于诊断和治疗的新基因靶点提供新的方向和基础。