基于网络药理学的菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的作用机制研究

李锦英 张兆萍 叶金飞 曾丽华 梁蕴仪 朱玲

摘 要 目的：探討菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的潜在作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、GenenCards和OMIM数据库获得菟丝子-枸杞子药对活性成分及卵巢早衰的相关靶点，利用Venn在线工具筛选两者的交集基因，并采用Cytoscape 3.7.0软件构建活性成分-靶点网络和靶点间蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络;通过DAVID数据库对交集基因进行基因本体（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，最终构建活性成分-靶点-关键通路网络。结果：筛选出菟丝子-枸杞子药对活性成分42个，成分及疾病靶点231、1 913个，节点度值排名靠前的化合物有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、黄豆黄素、豆甾醇和芝麻素等。活性成分靶点与卵巢早衰疾病靶点的交集基因共149个，交集基因的PPI网络共包含节点149个、边2 970条，平均节点度值为39.9，平均介数值为0.005 4。GO分析结果显示，上述交集基因的分子功能主要包括蛋白结合、酶结合等，生物过程主要涉及促进RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、促进DNA转录等，细胞组分主要包括细胞核、细胞质等，信号通路主要涉及癌症信号通路、乙型肝炎通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。活性成分-靶点-关键通路网络显示，菟丝子和枸杞子的主要活性成分均为黄酮类及醇类，关键靶点有蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤抑制蛋白P53（TP53）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）等，通路主要涉及癌症信号通路、乙型肝炎信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等。结论：菟丝子-枸杞子药对的多种活性成分可能通过PI3K/AKT信号通路、MAPK等多条通路作用于AKT1、TP53等多个靶点治疗卵巢早衰，并挖掘出潜在活性成分豆甾醇、芝麻素以及潜在靶点IL6、TNF。

关键词 菟丝子-枸杞子药对;卵巢早衰;网络药理学;作用机制

中图分类号 R285;R711.75 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）18-2202-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.05

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the potential mechanism of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure. METHODS： Main active components and related targets of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure were obtained from TCMSP， GeneCards and OMIM database. The intersection genes between them were screened using Venn online tool. Cytoscape 3.7.0 software was adopted to establish the active ingredients-target network and the PPI network. GO and KEGG pathway enrichment analysis on intersection genes were carried out by DAVID database. Finally， an active component-target-key pathway network was constructed. RESULTS： Totally 42 active components， 231 and 1 913 targets for active components and disease were obtained from couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus. The components with high node degree included quercetin，kaempferol，β-sitosterol，isorhamnetin，glycitein，stigmasterol and sesamin，etc.  There were 149 intersection genes between the active component targets and premature ovarian failure targets. PPI network contained 149 nodes and 2 970 edges，with an average node degree of 39.9 and an average medium of 0.005 4. The results of GO analysis showed that molecule function of the above-mentioned genes mainly involved protein binding，enzyme binding， etc. Biological process mainly included that positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter，positive regulation of transcription DNA-templated， etc. Cell components mainly included nucleus，cytoplasm，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signling pathway， PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. The results of active component-target-key pathway network showed that active components of Cuscutae Semen and Lycii Fructus were flavonoids and alcohols; key target included AKT1，TP53，VEGFA，IL6，TNF，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. CONCLUSIONS： Through PI3K/AKT signaling pathway and MAPK signaling pathway，the active components of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus may act on AKT1，TP53 and other targets，and then play a therapeutic role on premature ovarian failure. The Potential active components stigmasterol， sesamin and potential targets IL6， TNF were found.

KEYWORDS   Couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus; Premature ovarian failure;Network pharmacology;Mechanism of action

卵巢早衰（Premature ovarian failure）是临床上常见的生殖内分泌系统疾病，是指女性在40岁以前出现卵巢储备功能下降甚至衰竭的现象，临床主要表现为闭经、不孕、低雌激素症等，部分患者还可出现潮热多汗、烦躁不安、性欲低下、睡眠障碍、骨质疏松等围绝经期症状[1]。据调查，我国卵巢早衰的发病率为1%～3%[2]，是临床妇科医师关注的热点之一。现代医学治疗卵巢早衰主要有雌孕激素替代疗法、免疫疗法以及诱导排卵、卵巢冷冻移植等对症治疗方法[3]。而中医认为，卵巢早衰属“闭经”“不孕”“血枯”等范畴，病机总归肾虚，治疗当以补肾填精为主[4]。

网络药理学是药理学的分支学科，其是在药物、靶点、疾病相互作用的基础上，通过网络分析和生物信息技术等手段系统揭示多成分药物治疗疾病的相关机制[5]。该学科注重整体性、系统性和药物之间的相互作用，这与中医治病的整体观念相吻合。网络药理学与中药研究的结合，可为阐明中医药治疗疾病的作用机制提供新的研究思路和方法，有利于揭示中药治病的本质，并为中药研发提供强有力的理论支撑，进而推动中医药现代化的发展[6]。

菟丝子-枸杞子药对为左归丸、归肾丸、五子衍宗丸等治疗卵巢早衰方剂的核心药对，具有补肾填精的作用，临床上多用菟丝子-枸杞子药对治疗肾虚型卵巢早衰，疗效确切[7]。但菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的作用靶点及分子机制等尚不明确。为此，本研究拟借助网络药理学的方法探讨该药对治疗卵巢早衰的潜在作用机制，旨在为临床应用菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰提供基础生物学信息支撑。

1 资料与方法

1.1 菟丝子-枸杞子药对活性成分及靶点蛋白的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“Tu Si Zi”或“Cuscutae Semen”等为关键词搜索菟丝子的主要化学成分，以“Gou Qi Zi”或“Lycii Fructus”等为关键词搜索枸杞子的主要化学成分;以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为限定条件初步筛选其活性化合物，去除无明确作用靶点的成分后获得活性成分。同时，提取其蛋白质靶点。此外，为标准化靶点蛋白信息，统一将靶点蛋白转化成Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）的靶点。

1.2 卵巢早衰相关靶点的筛选

在 GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（http：//www.omim.org）中以“Premature ovarian failure”OR“POF”为关键词检索与卵巢早衰疾病相关的靶点基因，并记录靶点基因的Score值（Score值越高代表靶点与疾病之间的关系越紧密）;依据文献经验[8]，若疾病靶点过多，则将Score值大于中位值的目标靶点作为卵巢早衰的潜在靶点。合并各数据库的检索结果，删去重复值后获得卵巢早衰靶点。

1.3 主要活性成分-疾病靶点网络的构建

为明确菟丝子-枸杞子药对活性成分靶点与卵巢早衰疾病靶点间的关系，利用Venn在线工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制韦恩图，获得菟丝子-枸杞子药对活性成分靶点与卵巢早衰靶点的交集基因。将药材活性成分靶点与交集基因通过Cytoscape 3.7.0软件构建活性成分-疾病靶点网络图。以节点表示活性成分和靶点，节点之间的以边相连;节点度值表示与节点相连边的数量，其值越大，表示该节点在网络中越重要（下同）。

1.4 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将交集基因导入STRING数据库（https：//string-db.org），生物种类设定为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设定为“Highest confidence>0.9”，其余设置均为默认，构建PPI网络图，并通过Cytoscape 3.7.0软件进行可视化展示。

1.5 交集基因的富集分析

为阐明菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰潜在靶点在信号通路中的作用，采用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对交集基因进行基因本体（GO）富集分析和KEGG通路富集分析。限定物种为“Homo sapiens（人）”，标识符（Identifier）设置为“Official gene symbol（官方名称）”，设定P<0.001（P值反映生物功能的显著性及通路的富集程度，P值越小，则富集结果显著性越高）。将通路P值由小到大排序，并将富集结果导入微生信在线作图平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中进行可视化展示。

1.6 活性成分-靶点-关键通路网络构建

将前10条关键通路与菟丝子-枸杞子药对的活性成分、潜在作用靶点相对应，并通过Cytoscape 3.7.0软件构建活性成分-靶点-关键通路网络，直观地展现菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的复杂网络关系，阐释该药对治疗卵巢早衰的潜在作用机制。

2 结果

2.1 菟丝子-枸杞子药对活性成分筛选结果

通过TCMSP数据库检索共获得菟絲子活性成分10种、枸杞子活性成分35种，合并去重后共获得活性成分42种，详见表1。菟丝子作用靶点蛋白343个，枸杞子作用靶点蛋白364个，合并去重经Uniprot数据库标准化后得到靶点蛋白231个。

2.2 卵巢早衰相关靶点检索结果

从GeneCards数据库共获得卵巢早衰相关靶点基因3 830个，其Score最大值为201.03、最小值为0.24，中位数为4.39，故设定Score>4.39的靶点为卵巢早衰的潜在靶点，结合OMIM数据库补充相关靶点信息，合并去重后最终获得卵巢早衰疾病靶点1 913个。

2.3 主要活性成分-疾病靶点网络的分析结果

共获得菟丝子-枸杞子药对活性成分靶点与卵巢早衰靶点的交集基因149个，韦恩图见图1。将上述交集基因导入Cytoscape 3.7.0软件中，构建活性成分-卵巢早衰靶点网络图，详见图2。由图2可见，该网络含节点193个，其中药材节点2个、活性成分节点42个、靶点节点149个，成分与靶点之间边507条;活性成分平均节点度值为12.071 4，大于平均节点度值的活性成分有7个。其中，菟丝子和枸杞子共有活性成分槲皮素节点度值最大，为238，预测槲皮素为菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的主要活性成分;其次为山柰酚（菟丝子）、β-谷甾醇（菟丝子和枸杞子共有）、异鼠李素（菟丝子）、黄豆黄素（枸杞子）和豆甾醇（枸杞子）、芝麻素（菟丝子）。

2.4 菟丝子-枸杞子药对活性成分与卵巢早衰交集基因PPI网络的分析结果

菟丝子-枸杞子药对活性成分与卵巢早衰交集基因的PPI网络图见图3。由图3可见，该网络含节点149个与边2 970条，平均节点度值为39.9，平均介数值为0.005 4。菟丝子-枸杞子药对可能通过蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤抑制蛋白P53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）等关键靶点发挥治疗卵巢早衰的作用。

2.5 交集基因的富集分析结果

将交集基因导入DAVID 生物信息学数据库中进行GO分析，共得到GO条目247个（P<0.001），其中分子功能39个、生物过程185个、细胞组分23个，主要涉及蛋白结合、促进RNA聚合酶Ⅱ启动子转录等，且主要集中在细胞核，其中分子功能、生物过程、细胞组分富集基因数排序前10位的GO分析结果见表2～表4。KEGG通路富集分析共筛选出信号通路87条（P<0.001），主要涉及癌症信号通路、乙型肝炎信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、叉头框转录因子O亚族（FoxO）信号通路等，详见图4。

2.6 成分-靶点-关键通路网络的分析结果

将关键通路与“菟丝子-枸杞子”药对的活性成分、潜在作用靶点一一对应，构建活性成分-靶点-关键通路网络，详见图5。由图5可见，菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰涉及多个活性成分、靶点及通路。主要活性成分有菟丝子中的黄酮类及醇类，枸杞子中的黄酮类及醇类，主要靶点有AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF、CASP3等，通路主要涉及癌症信号通路、乙型肝炎信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路等。

3 讨论

菟丝子-枸杞子药对是中医临床治疗卵巢早衰的常用药对，具有补肾填精、调节肾阴阳平衡的功效，是左归丸、归肾丸、五子衍宗丸的核心药对[7，9]。现代药理研究显示，菟丝子的主要药理作用包括增强免疫力、调节内分泌、营养神经、增加冠脉血流量、降血糖、抗氧化和抗衰老等[10]，枸杞子的主要药理作用包括提高免疫力、抗氧化、抗衰老、保护神经、降压、降血糖、抗肿瘤等[11]。菟丝子-枸杞子配伍的现代研究表明，二者配伍可以治疗卵巢早衰、更年期综合征、不孕不育等疾病[7]。陳雯玥等[12]利用中医传承辅助平台对270个治疗卵巢早衰方剂组方药材的用药频次进行分析，结果菟丝子和枸杞子在处方中出现频次分别位居3、4位，可见菟丝子和枸杞子在卵巢早衰临床治疗中具有重要意义。目前，菟丝子-枸杞子药对配伍作用于卵巢早衰的药理学研究报道较少，因此本研究对菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的潜在作用机制进行了深入分析。

3.1 菟丝子-枸杞子药对活性成分与靶点分析

本研究共筛选出菟丝子-枸杞子药对潜在活性化合物42个，其中部分化合物已通过研究证实其具有保护卵巢的作用。例如，王永霞等[13]研究表明，菟丝子总黄酮具有类雌激素样活性，可以改善下丘脑-垂体促性腺功能和卵巢内分泌功能，促进卵泡发育，增加卵巢激素受体的数量，对改善模型大鼠的卵巢早衰有很好的效果。槲皮素能促进各级卵泡生长发育，增加颗粒细胞的雌激素分泌并促进其正常增殖，有效地改善卵巢功能[14]。β-谷甾醇具有雌激素样活性，可促进卵巢颗粒细胞产生雌激素，对卵巢早衰致骨代谢失衡具有协同调节作用[15]。在活性成分-靶点网络的构建中，菟丝子-枸杞子药对活性成分中节点度值较高的化合物有槲皮素、异鼠李素、山柰酚、β-谷甾醇、芝麻素、黄豆黄素、豆甾醇等，表明这几种化合物在保护卵巢功能中起着主要的作用，可能是菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的有效成分。但目前对于这几种有效成分的相关作用机制尚不明确，有待进一步深入研究。通过PPI网络的构建可以发现，菟丝子-枸杞子药对可能通过AKT1、TP53、CASP3等关键靶点发挥治疗卵巢早衰的作用，且结合GO富集分析、KEGG通路富集分析以及活性成分-靶点-关键通路网络，发现靶点涉及多种生物过程和信号通路与卵巢早衰的发生发展关系密切。目前已有相关研究发现，AKT1是PI3K/AKT信号通路中重要的下游靶激酶，参与了细胞生长的调控，当AKT1正常表达时，可以维持原始卵泡正常的生长发育，可以调节卵母细胞的生长和颗粒细胞的增殖分化，并可抑制细胞凋亡;当AKT1表达异常时，则会使原始卵泡生长发育失常，导致卵巢发生病理性改变，从而加速卵巢衰老的进程[16]。TP53也与卵巢颗粒细胞的凋亡和增殖密切相关[17]。CASP3是CASP家族中的一个凋亡效应子，在卵母细胞、颗粒细胞中均有表达，主要参与细胞凋亡过程，当CASP3系统被激活时可触发细胞凋亡，进而加速卵巢早衰[18]。可见，菟丝子-枸杞子药对可能通过调节以上主要靶点而发挥治疗卵巢早衰的作用。

3.2 菟丝子-枸杞子药对GO生物过程分析

通过GO富集分析发现，菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰涉及多种分子功能、生物过程和细胞组分。生物过程主要涉及促进RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、信号转导、氧化还原过程、炎症反应、促进细胞增殖、凋亡过程等。其中，凋亡过程与卵巢早衰的发生发展密切相关，当卵母细胞DNA受到损伤时，下游信号分子促凋亡基因被激活，可诱发细胞凋亡级联反应，直接或间接使卵巢储备功能下降[19]。氧化还原过程也在卵巢早衰的发生发展中发挥了重要的作用，某些化疗药物可以使活性氧增加，可能是由PI3K/AKT等信号通路介导产生，活性氧不仅可通过激活卵泡凋亡信号、上调凋亡蛋白和下调抑凋亡蛋白表达、破坏细胞微管结构和染色体排列来降低卵母细胞的质量，加速卵母细胞老化，还可以对线粒体脂质、脱氧核糖核酸和蛋白质造成氧化损伤，当线粒体受损时，可以触发线粒体自噬途径，受损的线粒体向胞质释放高水平的钙和细胞色素C，最终引起颗粒细胞凋亡或死亡[20-21]。与卵巢早衰相关的微小RNA（miRNA）的上调与下调对卵巢早衰的形成具有一定的作用[22]，并逐渐成为潜在的治疗靶点。在卵巢中miRNA的广泛表达在卵泡成熟过程中具有重要的作用，已有实验研究发现，西洋参能够通过增加miR-29a和miR-144水平来调节前列腺素的生物合成，以调节排卵、预防卵巢衰老，从而保护卵巢功能[23]。此外，有研究表明，卵巢早衰患者中IL6等炎症因子水平较高，可通过降低卵巢炎症反应、降低血清中炎症因子水平从而达到改善卵巢功能的目的[24-25]。以上均表明，菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰可能涉及了多种复杂的生物过程。

3.3 关键通路的相关机制分析

PI3K/AKT信号通路是卵巢早衰的重要通路之一，该通路与多种疾病发生有关，主要参与调节原始卵泡的发育、颗粒细胞的增殖分化、卵母细胞生长等过程，该通路中各信号分子表达异常会导致原始卵泡生长发育受限，阻碍颗粒细胞增殖分化，进而导致卵巢功能下降。FoxO信号通路为PI3K/AKT通路下游众多通路中的一条，相关研究发现，PI3K表达上调并激活AKT时，可以促进FoxO3a磷酸化并丧失转录活性，导致原始卵泡池过度激活，使卵巢原始卵泡和初级卵泡减少、卵巢纤维化、髓质破坏和卵巢萎缩，从而降低卵巢储备[26]。有研究表明，中药复方新加归肾丸可以通过增强PI3K/AKT信号通路的活性，从而促进卵泡的生长发育和颗粒细胞的增殖，抑制卵泡的过度闭锁，修复卵巢功能[27]。PI3K/AKT下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）对卵泡的调节起重要作用，mTOR活化水平下降则会阻碍卵泡生长发育;此外，过度活化的mTOR也会加速原始卵泡颗粒细胞的分化，过早激活休眠卵母细胞和原始卵泡，导致卵泡池过度耗竭，从而加速卵巢早衰[28]。进一步验证PI3K/AKT信号通路在卵巢早衰中具有重要意义。MAPK信号通路在卵泡生长、发育、成熟过程中有重要的调节作用[29]。Ras信号通路参与卵巢颗粒细胞的正常生长和增殖过程，间接影响卵母细胞的成熟，当通路中任一环节发生异常时，可以导致恶性肿瘤的发生[30]。TP53信号通路也是卵巢早衰发生发展的重要通路之一，TP53的一个同系物TAp63是DNA损伤凋亡通路的关键调控因子，当细胞DNA受损时，TAp63与磷酸化的非受体酪氨酸激酶c-Abl相互作用，激活下游信号分子促凋亡基因，诱发细胞凋亡级联反应，直接或间接使卵巢储备功能下降[31]。以上结果提示，菟丝子-枸杞子药对可能通过调节上述代谢通路进而改善卵泡的生长发育、颗粒细胞的增殖分化和卵母细胞的生长过程，发挥治疗卵巢早衰的作用。

4 结语

本研究通过检索共获得菟丝子-枸杞子药对的活性成分42个，活性成分治疗卵巢早衰的潜在作用靶点有149个。活性成分-靶点网络直观体现了该药对通过多成分、多靶点治疗卵巢早衰的特点;同时，靶点PPI网络反映出该药对治疗卵巢早衰相关的各靶点之间联系紧密;通过GO富集分析和KEGG通路富集分析发现，菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰涉及多种细胞生物过程和信号通路。以上均表明菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的作用机制较为复杂，涉及多个活性成分、作用靶点及生物通路。本研究对药物治疗作用的潜在分子机制进行了初步探讨，为进一步实验研究奠定了基础。但考虑到两味中药组合一起在煎煮时可能会发生复杂的化学反应，本研究忽略了菟丝子-枸杞子药对煎煮后的化学成分及药材中各成分的含量，故具有一定的局限性，其具体作用机制还需后续实验研究加以验证。同时，除現有相关研究报道的活性成分外，本研究还发现了菟丝子-枸杞子药对治疗卵巢早衰的其他潜在活性成分（芝麻素、豆甾醇等）以及靶点（IL6、TNF等），为卵巢疾病后续治疗及新药研发提供了参考。

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（收稿日期：2020-06-08 修回日期：2020-08-02

（编辑：邹丽娟）