双歧杆菌对肠道生理的调节作用

◆作者：钟浪杨飞宋诗莹张振伟张政中董海龙吴庆侠＊曾江勇马宏财

◆单位：1.西藏农牧学院动物科学学院；2.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所

双歧杆菌主要寄生在动物机体的肠道内，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用（孟祥晨，2002）。近年来，随着对双歧杆菌研究的逐渐深入，发现双歧杆菌对维持肠道的生理健康发挥着重要的作用（Ruiz等，2011）。GI作为动物机体内最大的吸收、消化、免疫器官(马博，2019)，对于维持动物机体整体的正常功能有着许多积极作用。目前来看，肠道疾病的发病原因仍然十分复杂。研究发现，肠道上皮屏障功能障碍是肠道疾病产生的主要原因（娄文静，2019）。彻底治疗肠道上皮屏障功能障碍，几乎是不可能的，所以预防肠道上皮屏障功能障碍是重点（孙莉莉，2019；Wheeler等，2016）。双歧杆菌作为肠道微生物的常见细菌之一，对于维持肠道黏膜作用十分明显。Joaquin Escribano等学者对190例人类新生儿进行随机、双盲的临床对照实验发现，以双歧杆菌作为配方奶粉喂养的新生儿比正常对照组的新生儿拥有更强的抵抗力。《Nature》杂志在2016年5月也公布了一项研究结果，它指出不同月龄的新生儿肠道菌群构成不同(Proctor L.M，2016)，其中双歧杆菌在新生儿肠道菌起到重要的作用。因此，本文就双歧杆菌对动物胃肠道的不同生理作用进行整理，以期为预防胃肠疾病的研究提供参考。

1 黏附肠粘膜的作用

动物机体拥有三种（物理屏障、化学屏障和生物屏障）屏障来保护机体不受病原微生物入侵(张萌萌，2019)。主要的原理是肠上皮细胞之间的紧密连接结合微生物及其他有毒物质形成一种黏液素的复杂糖蛋白混合物(Arslan M，2002)，而黏液素就是其中的主要成分(徐艳等，2015)。在动物机体胃肠道中存在多种微生物共生菌株，包括乳酸杆菌属、粪肠球菌属、大肠杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属等等。这些丰富的微生物之间有共生关系，还有拮抗、竞争关系。菌体黏附能力是双歧杆菌在肠道中定植的先决条件，其本身就具有很高的黏附性能。在具有人类粪便粘液分离物的体外模型中，双歧杆菌的粘附率高达30%(Rinkinen等，2003)，带有粘蛋白和Caco-21和/或HT29-MTX2细胞培养物的聚碳酸酯孔板粘附模型也表明双歧杆菌可以很好地黏附于板孔的不同组合(Laparra，等2009)。在体外研究中，双歧杆菌与其他乳杆菌菌株相比，对肠道粘液的粘附性更好。遗传研究进一步表明其具有增强菌株黏附特性的菌毛(Kankainen等，2009)，也是其发挥益生功能的基础(Gem EI等，2005)。这些菌株通过黏附肠粘膜的能力来黏附在肠上皮细胞上，通常将其鞭毛、菌毛、s层蛋白、黏附蛋白等多种结构于肠上皮细胞结合(陆德源，2005)，进而产生一层黏膜保护层，即肠上皮细胞的第一道防线，从而可以提高上皮屏障功能。

双歧杆菌黏附肠粘膜的机制如图1所示，双歧杆菌黏附肠粘膜的第一步就是其黏附在肠道上皮黏膜表面，主要通过其分泌的黏附蛋白黏附在肠上皮细胞绒毛上(Alp，D等，2019)。此时，具有较高亲和力、粘附力/附着力的双歧杆菌就成为了首选。在双歧杆菌附着期间，双歧杆菌会分泌双歧杆菌黏附素(熊睿，2016)，双歧杆菌黏附素一方面会提高同类菌属的附着比例(Iguchi等，2011)；一方面会占据其它可用的肠上皮细胞的受体蛋白，以抑制其他病原微生物的定植(胡乐，2019)。如果病原微生物进入肠上皮细胞，继而进入体液免疫内，也会又特异性的Th1细胞与其结合，继而发生其他的免疫反应(吴姚平，2017)。

因为双歧杆菌是革兰氏阳性菌，所以在双歧杆菌细胞壁上存在存在脂壁酸（LTA），因脂壁酸可与肠上皮细胞s层蛋白直接作用(Bnisch E等，2018)，从而通过LTA与肠上皮细胞建立黏附作用。此外，在一些研究中发现，双歧杆菌产生的胞外聚合物（EPS)也可以助双歧杆菌黏附于肠道上皮细胞，但EPS具体机制尚不明确(Alp，2019)。

2 改善胃肠道肠粘膜的通透性

在GI中，肠上皮细胞和免疫系统直接的相互作用，以此来维持肠道菌群的生理平衡(Li，C.，Gao，M.2016)。肠上皮细胞由肠上皮紧密连接、贴壁等和桥粒连接组成，其中肠上皮紧密连接在以前被学者认为是一个可以阻止生物大分子进入的屏障(Mokkala等，2017)。但研究发现，外界大分子物质想要穿过肠上皮紧密连接位置，需要与肠上皮紧密连接的特异性抗原相结合，才能顺利进入肠上皮细 胞内环境里(Liu等，2013)而肠上皮紧密连接部位主要是通过多种跨膜蛋白完成的，这些跨膜蛋白主要包括Occludin，Claudins，JAMs，ZO-1，ZO-2，ZO-3…等近五十多种蛋白(Qi等，2017)。肠上皮紧密连接的调节对于维持机体屏障内环境的稳定性十分重要(杜维霞等，2014)。最新研究发现，Zonulin连蛋白是目前已知的唯一可以影响肠道通透性的蛋白，但目前对Zonulin连蛋白产生的机制尚不明确（Sturgeon，2016）。向玲等（2016）对患有肠道炎症的小鼠喂食双歧杆菌发现，双歧杆菌确实可以降低小鼠血清中Zonulin连蛋白的含量，维持肠道紧密蛋白的完整性，从而降低肠道通透性，减少炎症肠道损伤。双歧杆菌影响Zonulin连蛋白的分泌可，能的机制如图2所示。

第一，当肠道上皮细胞发生炎症反应时，肠上皮细胞上的紧密连接可能会打开，大量细菌会破坏紧密连接复合体，此时肠上皮细胞的通透性增加，细菌通过被破坏的紧密连接进入肠道内环境，甚至血液循环系统中(Thevaranjan etusha等，2017)。

第二，在破坏紧密连接复合体的同时，Zonulin连蛋白分泌会增多，而双歧杆菌可通过本身特异性的蛋白结合一部分Zonulin连蛋白，使Zonulin连蛋白表达降低并改变其分布。从而降低肠上皮细胞的通透性(向玲，2016）。

3 抑制溃疡性肠结炎

溃疡性肠结炎（UC）的发病原因有很多，目前可以确定的是UC与特定的肠道功能实质性发生改变有关(Duranti Sabrina等，2016)。还可能与胃肠道的共生菌群介导的保护有关（Kato K等2004)。Sabrina Duranti等人发现，对服用双歧杆菌的小鼠，其所有结肠炎相关的组织学指标均显著降低，并且粘膜完整性得以维持。从2中知道，双歧杆菌可以通过影响肠道上皮细胞的通透性来抑制肠道炎症。这些结果说明了双歧杆菌作为UC的微生物防治药物的客观性。研究发现，双歧杆菌可以调节宿主的代谢和免疫活性(Jean Guy等，2013)。其参与调节动物机体的机制方式有四种：第一，外服双歧杆菌可以通过抑制还原性辅酶的活性，在某种程度上减少氧化组分对UC的损伤(姚君等，2010)；第二，双歧杆菌会通过其菌毛及黏附蛋白黏附在肠道上皮细胞上，竞争性抑制其他微生物病原的生长定植于肠上皮细胞，继而减少UC的继发性性感染(Doherty GA等，2010)。第三，增强肠上皮屏障能力，维持肠道紧密连接的完整，进而保护肠道不受其它致炎因子刺激(Hamazaki等，2002）；第四，双歧杆菌定植肠上皮细胞后，会刺激特异性免疫及非特异性免疫系统分泌lgA、多种T细胞及抗炎因子，进而减轻炎症反应（Pena JA等，2000）。原理如图3、图4所示。

图1 肠道上皮共生菌群作用图(Atarashi，K.2015)

图2 肠道上皮细胞与血液循环系统（图片来源于百度百科）

当胃肠道发生炎症后，肠道被多种促炎性因子（IL-1，IL-6，脂多糖（LPS），TNF-α或病原体）刺激。机体内就会多种免疫细胞与之结合反应，比如成熟的树突状细胞（DC）、巨噬细胞、NK细胞或在存在抗炎性刺激TGF-beta和IL-10以减轻炎症反应。研究发现，双歧杆菌会通过其菌毛及黏附蛋白黏附在肠道上皮细胞上，当双歧杆菌进入机体特异性免疫环境时，就会与未成熟的DC结合并分化为成熟的DC或产生耐受性的DC。成熟的DC在经历一系列刺激功能，根据产生的细胞因子刺激Th或Treg细胞。成熟的DC与未成熟的CD4+T细胞通过CD4+T细胞的细胞因子相互作用并分化为以下两种：（1）炎症性Th1（分泌性 IL-1，IL-6，IL-12，IFNγ，TNF-α）或Th17（分泌性IL-17 A，IL-17 F，IL-21，IL-22）细胞；（2）抗炎性Th2（分泌性IL-4，IL-5，IL-9，IL-10，IL-13，IL-33）或Th9（分泌性IL-9）细胞；（3）调节性Treg（分泌性IL-10，TGF-β），Th3（分泌性TGF-β）或Tr1（分泌性IL-10）细胞；（4）分泌IL-22的Th22细胞。此外，Th17细胞可进一步分为IL-17，IFN-γ或IL-17，TGF-β双 重分泌细胞。双歧杆菌可以与某些菌株发生特异性反应，根据菌株和疾病调节Treg细胞和Th2细胞的能力参与DC与T细胞相互作用。

图3 GALT免疫系统与肠道微生物的相互作用关系(Dargahi，2019)

4 增强肠上皮屏障功能

肠道上皮屏障功能主要指肠道能够防止肠内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环的结构和功能的总和（魏保生，2004），也是细菌和毒素进入动物机体的第一道防线，可防止肠壁穿透不需要的抗原（韩华中，2012）。肠上皮屏障功能的存在直接可以影响肠上皮细胞的通透性和肠道炎症的恢复和治疗。对肠上皮屏障功能影响最大的就是肠道上皮紧密连接部位，这也是目前最主要的研究方向（Akiyama，2016；王 海 珍，2019；Nilusha Malmuthuge，2019）。在动物肠道微生物菌群中，存在着许多可以增强肠上皮屏障功能的益生菌（乳酸菌、肠球菌、双歧杆菌等等）(Chen-Yu Hsieh，2016）。双歧杆菌主要依靠三种方式来增强肠上皮屏障功能：

第一，如图1所示，双歧杆菌通过其超强的黏附能力对肠上皮细胞进行占位、定植，进而抑制其他微生物病原的定植。大量的双歧杆菌可以对肠上皮细胞形成一层保护膜。

第二，如图2所示，双歧杆菌主要通过对Zonulin连蛋白的调控来反馈增强肠上皮屏障功能。

第三，双歧杆菌菌属的代谢产物（如乙酸盐）对跨上皮电阻（TER）有增强的作用，TER可促进肿瘤坏死因子（TNF-α）对结肠腺癌细胞（Caco-2）单层的伤口修复，进一步增强肠上皮功能(Mokkala，2016；XiaqiongMao，2020)。

图4 双歧杆菌与DC细胞（史佳鹭，2019）

5 抑制其它微生物病原

动物机体的肠道中存在着多种共生菌群，共生菌群的平衡对动物健康起着十分重要的作用(Inquimbert Camille，2019)。特别是一些参与上皮屏障功能的微生物菌群，其最重要的作用就在于可与其他外源性微生物病原菌竞争、拮抗，以此保证上皮屏障功能的完整性(狄治杉，2019；Kim，2018)。双歧杆菌是在肠道细菌中占有50%～80%的比例(Jost，2012；Turroni，2012)，其竞争性、排斥性以及它们能置换和抑制病原体的能力在肠道健康中影响十分广泛。双歧杆菌抑制微生物病原的机制有很多可能性，如：（1）双歧杆菌分泌许多抑制其它微生物生长繁殖的物质，(Marco，2006)；（2）双歧杆菌对有限的营养成分进行竞争或者对黏膜上的免疫细胞的刺激使其周围的pH下降，以此降低其它不耐酸微生物的生长；（3）双歧杆菌与微生物病原竞争肠粘膜上的黏附点，使其增强对微生物病原菌的抵抗力；（4）高铁螯合双歧杆菌还能在体外抑制肠病原菌的生长和对肠上皮细胞的粘附。

6 总结

不管是双歧杆菌以何种方式影响动物机体肠道菌群，归根结底在于双歧杆菌对肠道上皮细胞的定植、占位作用；对于微生物病原和双歧杆菌而言，黏附于上皮细胞是重要的一步，只有它们之间有一类菌株黏附在了肠上皮黏膜上，就会产生许多有利于动物机体健康的作用，同时，表明了益生菌抑制粘附或与病原体竞争以及置换先前粘附的病原体的能力。其次就是在于其对肠上皮紧密连接及Zonulin连蛋白对肠道上皮通透性的影响。肠道上皮细胞的通透性必须使内外环境相平衡，通透性越高就说明其肠道上皮紧密连接蛋白越少，就会引起乳糜泻、糖尿病、炎症性肠病等疾病。通透性低影响某些大分子物质进入机体内环境。我们对双歧杆菌的很多机理研究的依然不够深入，需要我们不断地探究。