利用线粒体DNA对飞机撞击后鸟类残体的分子鉴定

冯 慧， 王 璐， 冯成利

(陕西省秦岭珍稀濒危动物保育重点实验室 陕西省动物研究所， 西安 710032)

随着PCR和DNA测序技术的发展，物种鉴定技术从传统的宏观形态鉴别发展到依靠核酸鉴别。线粒体DNA(mtDNA)具有分子结构简单、进化速率快、无重组、多拷贝及严格的母系遗传等特点[1-2]，可以敏感地区分种内和种间DNA序列的细微差异[3-4]，该技术广泛应用于哺乳类、鸟类、鱼类和昆虫类物种的分类。

本文对2019年6月收到的一起鸟类撞击飞机残体进行形态鉴定，并选择mtDNA细胞色素b基因(Cytb)和细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)进行分子鉴定。通过测序得到的待测鸟类mtDNA序列和GenBank已发表序列构建系统进化树，确定鸟类残体的物种类别。探讨Cytb序列和COⅠ序列作为DNA条形码对鸟类进行物种鉴定的准确性和实用性。鉴定结果可以为飞机抗撞击实验提供准确数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品来源于西安飞机工业公司试飞站，飞机撞击后鸟类残体。包括一个初级飞羽，一些带少许肌肉的绒毛。

1.2 实验方法

1.2.1 形态学鉴定

根据残留初级飞羽形态，参照文献[5-8]，并辅助研究所内的鸟类标本，进行形态学鉴定。

1.2.2 DNA提取

DNA提取采用Promega公司的动物组织DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用手册对鸟类残体组织进行全基因组DNA提取。

1.2.3 mtDNACytb序列和COⅠ序列的PCR扩增、测序

mtDNACytb序列的PCR扩增采用一对鸟类mtDNACytb通用引物，L14851：5′-CCTACTTAGGATCATCGCCCT-3′，H16065：5′-GTCTTCATCTCCGGTTTAC AAGAC-3′[9]；COⅠ序列的PCR扩增采用一对鸟类mtDNACOⅠ通用引物，L6615：5′-CCTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3′，H7956：5′-GGGTAGTCCG AGTATCGTCG-3′[10]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

PCR反应体积为(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各2.5 μL，Taq酶0.4 μL，超纯灭菌水补齐至50 μL。Cytb序列PCR反应体系为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35循环，最后一循环72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存备用。COⅠ序列PCR反应体系退火温度为44 ℃，其余条件与Cytb序列扩增反应体系相同。

将Cytb序列和COⅠ序列PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。

1.3 数据对比

利用Chromas软件对测序结果图谱进行验证、拼接。将拼接后的mtDNACytb基因序列和COⅠ基因序列在GenBank(网址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)在线数据库，用BLAST软件进行在线比对分析。然后下载对比排列前10物种的基因序列，再加上哺乳动物野猪的mtDNACytb和COⅠ序列作为外群，构建系统发生树进行验证。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

该飞羽为蓝黑色具有金属光泽，形状狭长，长度为127 mm，对比所内标本后确定为金腰燕(Cecropisdaurica)，为雀形目，燕科，燕属动物。

2.2 扩增结果

mtDNACytb基因扩增后共得到965 bp序列，COⅠ基因扩增后共得到749 bp序列。图1为mtDNACytb基因和COⅠ基因扩增后电泳图。

M： Marker DL 2000; 1: Cytb; 2: COⅠ

2.3 与GenBank中序列对比结果

用BLAST软件在线比对后，mtDNACytb基因PCR产物与基因库中序列号为 GU460265.1普通家燕(Hirundorustica)的mtDNACytb序列相似度为99.48%，965 bp共有5个碱基差异。

mtDNACOⅠ基因PCR产物与基因库中序列号为KP148840.1普通家燕(Hirundorustica)的COⅠ序列相似度为99.81%，749 bp共有2个碱基差异。

在GenBank对比排列前8的动物为：安哥拉燕(Hirundoangolensis)、白喉蓝燕(Hirundonigrita)、珠胸燕(Hirundodimidiata)、白喉燕(Hirundoalbigularis)、白尾燕(Hirundomegaensis)、红额燕(Hirundoaethiopica)、线尾燕(Hirundosmithii)和喜燕(Hirundoneoxena)，相似度范围为96.90%～94.85%。

将上述10种动物和金腰燕(Hirundodaurica)的Cytb序列和COⅠ序列下载，同时下载鸭科大天鹅(Cygnuscygnus)和哺乳纲偶蹄目野猪(Susscrofa)的Cytb和COⅠ序列作为外群对比序列，构建NJ系统发生树，结果见图2和图3。

图2 基于Cytb序列构建的NJ系统发生树

从Cytb序列和COⅠ序列构建的两个系统发生树可以看出，检测样品和家燕的关系最近，聚为一枝，和金腰燕的关系比较远；检测样品与天鹅和野猪的关系最远。由此可以推断，检测样品为家燕。

3 讨论与结论

3.1 形态鉴定与分子鉴定

本次鉴定中，形态学鉴定为金腰燕，分子鉴定为家燕，聚类分析中待鉴定样品与金腰燕的关系比较远。金腰燕与家燕外形相似，区别在于金腰燕腰部呈栗色，家燕腰部为蓝黑色，翅膀长短、颜色区别不大。在本案例中，腰部羽毛缺失，仅从一根翅膀羽毛分辨，有一定误差性。形态鉴定的局限性体现在：1)待鉴定样品仅为肌肉组织、残肢、骨头；2)动物发育阶段不同影响，如幼体外形相似的动物(毛冠鹿、狍子、小麂等)；3)不同生态环境下，相同基因型产生不同的表型变化；4)对形态鉴定人员的分类经验要求较高[11]。分子鉴定的优势是可以准确识别物种的局部组织，鉴定样品不受物种发育阶段以及个体形态特征的影响，不受物种的限制，并且有利于发现新种和隐存种；此外，该技术的准确度高，实验操作简单、不受鉴定人员经验限制、易于掌握和推广[12-14]。

但是分子鉴定也有一定的局限性。1)近源种不易区分。有些近源种的分子差异非常小，在分子鉴定时通常选用的是mtDNA保守区的通用引物，序列比对时相似性均在99%以上。如家猪、野猪、家猪和野猪的杂交品种，这几种动物mtDNA几乎没有差异，在鉴定时经常难以区分；家犬和狼，在用mtDNA通用引物扩增后，也无法区分，在鉴定时还需要对特有位点进行检测[15-16]。2)序列库中无比对序列。在鉴定时通常选用NCBI数据库或BOLD system数据库[17-18]，这两个数据库为开放数据库平台，但是并不是所有物种的基因序列数据都上传至数据库，因此有时不能比对出正确结果。如翼手目动物蝙蝠的数据较少，本课题组在比较时经常出现相似性仅有95%或更低的情况出现[19-20]，在鉴定时仅能鉴定至属，不能鉴定至种。3)鉴定所需时间长。分子鉴定经过DNA提取、PCR扩增、DNA测序等一系列实验，有时还需重复实验才能得出结论，不能满足某些刑事案件的时限要求。

3.2 mtDNA Cytb和COⅠ基因在物种鉴定中的应用

mtDNACOⅠ和Cytb基因相对于其他mtDNA基因和核基因来说，具有以下2个优点。1)具有较高的保守性，一般通用引物可以扩增出来；2)变异速率较高，能够区分种间差异[14]。因此mtDNACOⅠ和Cytb基因被广泛应用于物种鉴定。二者比较，在种水平上的鉴定，Cytb基因和COⅠ基因得到的鉴定结果一致性较高[21]；Cytb基因比COⅠ基因进化速率快，但COⅠ基因拥有更多的系统发育信号[22]，COⅠ基因更适合应用在亚种水平的鉴定[23-25]。有的物种COⅠ基因种间差异性非常小难以区分，比如大部分的腔肠类(Cnidaria)动物[26]，在鉴定时需要参考Cytb基因鉴定作为辅助。

3.3 种内种间基因序列差异

虽然mtDNACOⅠ基因和Cytb基因不同物种间的进化速率不同，但是研究发现大部分的物种COⅠ基因和Cytb基因的种内个体间序列差异在1%～2%之间[27-30]。在本次实验中，待测样品与普通家燕的COⅠ基因序列差异为0.19%，Cytb基因序列差异为0.52%，均在1%以下。但种间差异较大，尤其是与普通家燕外形相似，仅在腰间有一金色条带的金腰燕，序列差异数为125个，差异率达到12.97%。这种形态差异较小，但基因序列差异较大的情况也出现在鲌属鱼中[31]。由此可见，虽然外形比较接近的两种动物上分类在同一属的动物其基因序列差异反而会比较大。

3.4 分子鉴定在野生动物保护中的应用

鉴于动物分子鉴定的诸多优势，在野生动物保护中也有很广泛的应用前景。1)发现隐存种。隐存种是指因外形相似，而基因特征差异较大的物种。形态学分类通常将其划分为同一个物种，随着PCR技术的发展而逐步分离出来。如长颈鹿是单型种属，有9个亚种，最新的研究发现有4种长颈鹿mtDNACytb基因已有明显的遗传分化[32]。Hebert利用mtDNACOⅠ基因研究哥斯达黎加的一种普通蝴蝶，结果发现有10个隐存种[33]。隐存种的发现，可以更加准确地评估区域生物多样性情况，对于濒危野生动物针对其不同分化制定不同的保护措施[34]，对野生动物的管理和保护有重要意义[35]。2) 野外调查时能准确识别区域内野生动物种类。粪便是野外调查比较常见的野生动物痕迹，有时同食性的近缘种动物粪便相似性非常大，难以区分。如笔者所在单位在陕北进行原麝调查时，其粪便与狍子幼体粪便难以区分；在秦岭调查时，小型食肉类动物粪便难以区分，如猪獾和狗獾、金猫和豹猫等。通过分子鉴定，可以准确识别粪便为何种动物，从而清晰掌握野生动物的种类和数量，减少调查时的误差，为野生动物保护部门拟定相关保护规划、起草相关法律法规提供理论依据。3)打击野生动物非法贸易犯罪行为。自古以来我国便有食用、药用、衣用、饲养和观赏野生动物或其制品的传统。尽管国家制定了一系列法律法规，但野生动物盗猎、贸易等违法行为屡禁不止，危害物种生存，破坏生态平衡。许多犯罪分子为了逃避打击，通常将野生动物剥皮、肢解，或烘干打粉入药，形态学难以鉴别，如不能准确识别涉案样本，会影响案件的性质和涉案价值。分子鉴定能够解决上述问题，为相关执法部门提供办案依据，为国家挽回经济损失。