果蝇tap基因表达模式的测定

王 越， 胡 澍， 汪欣怡， 张明炎， 蒋 豫

(河南科技大学 医学院， 洛阳 471003)

原神经模式是果蝇神经系统发育的重要机制之一，原神经基因的特异性表达引起蛋白产物的累积，通过Notch 信号通路介导的侧向抑制催生并确定神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPC)，而后NPC经过增殖分化形成各类神经元和胶质细胞，最终构成了复杂的神经系统，原神经基因对神经发生起着决定性作用[1-3]。tap基因可能具有原神经基因功能，通过原神经模式调节神经前体细胞分化，赋予神经元和胶质细胞各自独有的特征，而参与果蝇神经系统的发育过程[4]。

果蝇tap基因，也称为biparous，由两个研究小组分别针对mec-3和delilah两个基因的bHLH结构域，通过低保真度杂交和PCR筛选鉴定而来。其序列全长约2.13 kb，物理定位于3号染色体左臂，细胞遗传学定位于74A5[5-6]。通过序列比对，发现tap碱基序列与脊椎动物的neurogenin(ngn)和neuroD的序列相似度最高。三者被视为直系同源基因。从功能角度看，脊椎动物ngn表现出原神经基因的特征，在脊椎动物中始动了神经发生过程。neuroD通常作为原神经蛋白的下游基因，调节神经分化过程[7]。而作为它们的同源基因，果蝇tap基因的功能及表达模式尚未知。

利用具有时间、空间特异性的启动子界定GAL4 的表达，后者能立即结合UAS序列，使得UAS序列控制下的目标基因的表达呈现与启动子相同的时空特异性[8-9]。本实验利用已有的tapGal4品系(tap基因的编码序列被Gal4基因的编码序列准确取代[10])杂交后得到基因型为tapGal4/UAS-GFP的胚胎、蛹、幼虫、成虫，进行GFP免疫荧光染色，展示tap在果蝇发育过程的表达模式，为研究tap基因的功能和调控提供时空依据。此项研究不仅丰富了对神经bHLH蛋白家族功能的认识，也为脊椎动物ngn同类研究提供参照依据。通过tap和ngn两者功能的系统比对，明确同一基因在不同物种发育中功能与调控的异同，并从进化层面加以探索解释。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

tapGal4品系由胡澍在比利时鲁汶大学Bassem Hassan实验室攻读博士学位时制备，所有权归该实验室。实验中使用的其他品系则订购于美国bloomington果蝇品系中心。

1.1.2 试剂

免疫荧光一抗：大鼠抗Elav；兔抗GFP，小鼠抗22C10；小鼠抗Repo；小鼠抗Pros；小鼠抗-24B10购自Developmental Studies Hybndoma Bank(DSHB)；小鼠抗视紫红质3(Rh3)(单克隆，由Steven G.Britt，University of Colorado，USA提供)；

荧光二抗：山羊抗兔488；山羊抗大鼠655;山羊抗小鼠555购自北京博奥森生物。

1.1.3 实验仪器

激光共聚焦显微镜(Leica DM-RXA)；体视显微镜(Motic SMZ168)；高速冷冻离心机(SIGMA3K15)；超低温冷冻储存箱中科美菱(DW-HW50)；四维旋转混匀器其林贝尔(BE-1100)。

1.2 方法

1.2.1tap在果蝇胚胎、幼虫、蛹、成虫各阶段表达模式的测定

果蝇胚胎免疫荧光染色：收集果蝇胚胎，将胚胎用0.2%PBT溶液冲洗3遍，用4%多聚甲醛室温固定20 min，0.2%PBT洗3次，每次20 min， PAXDG室温封闭胚胎1 h后，加入一抗 (用PAXDG稀释到工作浓度)，4 ℃过夜。再加入所需二抗，室温孵育1 h。二抗结束后，0.2%PBT洗4次，每次20 min。最后加入Vectashield封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察、拍照。

果蝇幼虫免疫荧光染色：将果蝇三期幼虫固定于1×PBS的解剖盘中，用解剖镊子固定果蝇幼虫头部，另一只手拿解剖镊子于幼虫第二、三结处夹住表皮，从头向尾部撕下幼虫表皮，剥离出大脑与成虫盘，放入固定液中室温固定20 min，结束后0.3%PBST洗3次，每次15 min，室温封闭1 h，再加入所需的一抗稀释至工作浓度，室温或4 ℃过夜。一抗结束，用0.3%PBST洗3次，每次15 min，再加所对应的二抗室温孵育1 h，洗去二抗，盖玻片封片，激光共聚焦下观察，拍照。

果蝇蛹期免疫荧光染色：将适龄果蝇蛹放入2%多聚甲醛室温预固定10 min，除去外壳，破坏蛹的外皮，以便固定液更好地固定样品，再把解剖好的样品放入2%多聚甲醛室温固定1 h； 0.2%PBT洗3次，每次15 min，PAXDG室温封闭1 h，一抗4℃过夜，荧光二抗避光孵育2 h，封片后激光共聚焦下进行观察拍照。

果蝇成虫免疫荧光染色：将CO2麻醉后的果蝇放入1×PBS中，用解剖镊子将果蝇头部与身子分离，剥离头部外骨骼和白色纤维，保持大脑完整；将解剖好的样品放入固定液中室温固定,之后的步骤与果蝇蛹期免疫荧光染色相同。染色结束后在激光共聚焦下进行观察拍照。

1.2.2tap基因在复眼发育中的动态表达的测定

选择三龄期幼虫作为解剖对象，将其浸泡于PBS中并拉出眼一触角成虫盘，立即放入PBS清洗。用4%多聚甲醛固定20 min，PAXD透化2次，每次20 min，PAXDG封闭20 min，加入所需一抗4 ℃过夜孵育，次日室温二抗避光孵育1 h，PAXDG, PAXD, PBS室温依次洗10 min。再用4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS冲洗2次，每次15 min，盖玻片封片，激光共聚焦下拍照。

分别选择三期幼虫发育30、50和70 h转变而成的蛹作为解剖对象，免疫荧光观察tap在不同蛹阶段复眼发育的表达模式。

1.2.3 果蝇tap在成虫大脑的表达模式的测定

选择成虫果蝇大脑为样品，4%多聚甲醛固定30 min，PAXDG室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜，荧光二抗避光孵育2 h。封片后激光共聚焦观察拍照。

1.2.4 纯合tapGal4在胚胎时期的表达测定

收集基因型为tapGal4/TM6B-Ubi-GFP的胚胎。Ubi-GFP是果蝇平衡品系的显性标记物，其在果蝇组织中普遍存在GFP信号。选出丧失该显性标记的纯合的tap突变胚胎(tapGal4/tapGal4)。通过对果蝇胚胎时期GFP，Elav和22C10免疫染色观察纯合tapGal4的表达模式。

2 结果与分析

2.1 tap在果蝇胚胎阶段表达模式

在tapGal4与UAS-CD8-GFP杂交后的子代中，通过GFP信号间接展示tap在果蝇胚胎时期的表达模式。从胚胎第13期开始，可观察到tap在果蝇中枢神经大脑，腹部神经索和周围神经节神经束中广泛表达(图1)。

2.2 通过免疫荧光染色观察果蝇tap在幼虫、蛹和成虫不同时期的表达模式

tap在果蝇三期幼虫时期的腹部神经索和大脑有广泛表达(图2-a)。蛹和成虫阶段，逐渐局限于中脑和视叶，特别在成虫蘑菇体和中枢复合体中有广泛表达(图2-b、c)。

a：tap在腹部神经索和周围神经节神经束中广泛表达；b：在大脑广泛表达，触角复合体(箭头)和Bolwig器官(箭头)中可见表达信号；c：显示tap在侧向脊索器官(箭头)的表达，其形态易识别(连续5个神经元排成一行)。果蝇胚胎头部位于所有照片的上方

a：tap(绿色)在三期幼虫中脑和视神经中广泛表达；b：tap(绿色)在蛹期的中脑和视神经中广泛表达；c：tap(绿色)在视神经大量表达，特别是成虫中的蘑菇体和中央复合体

a：tap(绿色)在三期幼虫的眼盘后缘R7细胞中表达；b：在蛹发育初始阶段的眼盘后缘的R7细胞中的表达tap(绿色)；c：30%蛹阶段tap(绿色)在眼成虫盘的表达；d、e：50%蛹阶段tap(绿色)在蛹发育50 h视网膜后部的R7细胞中表达情况；f：tap(绿色)在蛹发育70 h视网膜前部区域的R7细胞中表达，此时也在触角有表达

2.3 tap在复眼发育中的动态表达模式

在果蝇三期幼虫阶段，tap在眼成虫盘最后缘R7光感受器中有特异性地表达(图3-a)。在蛹阶段，tap表达在复眼的所有R7细胞中(图3-c)。在蛹阶段晚期，tap表达从眼部向触角移动(图3-f)。R7细胞中的tap表达呈现由复眼后缘向前缘划过的瞬态波，然后开始在触角中表达。

2.4 tap在成虫大脑的表达模式

解剖成虫果蝇大脑，利用免疫荧光对GFP，Elav(神经原细胞标记物)和Repo(神经胶质细胞的标记物)免疫染色，结果显示在中脑和视神经叶中的GFP信号仅与Elav共定位，表明tap仅在神经元中有表达，在神经胶质细胞中不表达(图4-a)；中脑轴突中的GFP与Elav共定位(图4)表明tap在神经元细胞表达。

2.5 纯合tapGal4突变体在胚胎时期的表达结果

通过免疫荧光染色13期纯合tapGal4/tapGal4胚胎，以及同一发育时期的野生型胚胎。染色对比后，清楚可见前者蓝色标识的神经元胞体分布无序，说明此时大量神经元胞体缺失。再比较两者腹部神经索的发育，纯合子tap变异体的神经元形态、轴突分布及排布无一是完整的(以图5-b野生型为对照)，导致死亡。而对杂合tapGal4/balancer::ubi-GFP品系胚胎免疫荧光染色，可清楚地看到发育正常的神经元轴突树突(图5-b)。由此可以进一步判断，纯合tapGal4/tapGal4在胚胎期致死。

a：纯合的tap突变体(tapGal4 /tapGal4)导致严重的轴突缺失及发育异常；b：对照组(tapGal4/balancer::ubi-GFP)为正常的神经元轴突和树突生长和分布

3 讨论与结论

通过对比碱基序列相似度，果蝇tap基因被认定为脊椎动物ngn基因的直系同源基因，且编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白。ngn家族由ngn1、ngn2和ngn3三个亚族构成，均在神经前体细胞中表达，体现出明显的原神经基因特性，进而作为转录因子参与神经细胞增殖与分化等过程。哺乳动物ngn1和ngn2可在神经发育早期的端脑皮质脑室带中表达。ngn2是一种特异性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，在神经发育过程中控制神经元的命运，促进神经元分化[11]，ngn1、ngn2与E47等结合形成异源的二聚体，然后与特定的DNA序列作用，调节靶基因的转录活性和表达，进而决定着神经元的特性和分型[12]。tap基因是果蝇体内唯一的ngn同源基因，编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白。通过对纯合tapGal4/tapGal4胚胎免疫荧光染色，可观察到13期果蝇胚胎神经轴突缺失及发育异常，神经元轴突分布无一是完整的，导致胚胎死亡。说明tap是果蝇神经系统正常发育不可缺失的基因。本实验利用免疫荧光染色技术，检测tapGal4/ UAS-GFP子代的GFP信号，间接地追踪tap在果蝇不同的发育阶段的表达。在果蝇胚胎时期、幼虫时期及蛹期的中枢神经、周围视神经均有广泛表达，特别是成虫果蝇的大脑海马体及中央复合体、视神经中有特异性表达，这与脊椎动物ngn在神经系统发育中有重要作用是一致的，能给脊椎动物ngn的相关研究提供参考和借鉴。

ngn基因的突变、缺失会引发神经系统疾病，内分泌2型糖尿病和新生儿糖尿病等[13-14]。最新发现ngn1是内耳中毛细胞和神经元产生至关重要的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子[15]。ngn3不仅在人和小鼠的神经组织中表达，也是胚胎早期胰岛发育的关键转录因子之一，在胰腺细胞的分化和命运决定中起重要作用[16-17]，是胰腺和肠道内分泌谱系形成所必需的[18]。这表明ngn不仅在脊椎动物的大脑神经系统有重要作用，同时对其他器官的发育和功能也有调节作用。目前尚未发现ngn在眼部器官的相关报道，有趣的是，本实验通过免疫荧光染色GFP,可清楚地观察到tap在三期幼虫视网膜后缘R7光感受细胞中特异性地表达，表明tap对果蝇复眼的发育有重要影响，但具体作用机制尚未明确。对此的进一步研究有可能丰富对神经bHLH蛋白家族功能的认知。

综上所述，本实验利用Gal4系统和果蝇免疫荧光染色技术[19], 对tap基因在果蝇不同发育阶段，即胚胎、幼虫、蛹和成虫4类样本中GFP的染色，系统地描绘出tap在果蝇发育过程中的表达模式。这为后续该基因的功能与调控研究奠定了基础。本实验也有不足之处，因为一直未能成功制备tap特异性抗体，只能利用tapGal4/UAS-GFP间接地描绘tap的表达模式。在后续的实验中，我们将继续尝试制备tap特异性抗体，以及对tap基因的功能和调控进行深入的研究。