纳米细菌纤维素复合物支架用于MDCK细胞三维培养的研究

关业茂， 王庆江， 刘 静， 王海英， 曾晓波

(1. 武汉大学 口腔医院， 武汉 430079； 2. 武汉大学 药学院， 武汉 430071； 3. 中南民族大学 生命科学学院， 武汉 430074)

在二维单层细胞培养体系中，动物细胞贴附于培养容器的内表面，细胞表面只有部分与相邻细胞接触，无法完整呈现细胞间的真实相互作用。三维培养条件下的细胞几乎全部与其他细胞或基质接触，细胞在基因表达、信号传导和形态特征方面更接近于体内的生长模式，具有构建组织和器官的可能性，因此广泛应用于组织工程学的研究中[1-2]。三维培养技术利用各种材料与方法，使细胞在立体空间中生长，形成类似体内的组织结构，诱导其发挥生理功能。常见的三维培养技术包括自发细胞聚集、悬滴培养、微载体培养、预制支架培养、动态旋转培养、微流控芯片和三维打印等[3-5]。其中提供预制支架的三维培养能够为细胞提供支撑结构，在以组织修复和功能重建为目的的医学研究中广泛使用[6]。以Matrigel和胶原为代表的天然支架材料，由于价格昂贵等原因，除了在研究中广泛使用，在大规模组织培养中尚有一定限制；以聚酯类可降解聚合物为代表的人工合成支架材料，则存在对细胞的附着能力较弱，以及可能残留的合成单体毒性问题。因此寻找性能优秀、抗原性低和无毒的天然支架材料，是三维细胞培养的一个可行方向。

MDCK细胞(Madin-darby canine kidney cells)是源于考克斯班尼犬肾脏的上皮样细胞，被广泛用作远曲小管或集合管的模型。MDCK细胞进行立体生长时，细胞的极性会建立，细胞相连形成管状拟肾小管结构，是研究三维培养下细胞状态的良好材料[7-8]。本研究以天然来源的纳米细菌纤维素和海藻酸钠形成凝胶复合物，研究MDCK细胞在其中的三维培养情况，评价该材料开发用于细胞三维培养基质的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

细菌纤维素(Bacterial cellulose, BC)为本实验室分离纯化的木醋杆菌发酵所得，MDCK细胞为本实验室保存。细胞培养用DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS和0.25%胰酶/EDTA(Gibco，美国)，Matrigel (BD，美国)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Roch，瑞士)，Rhodamine Phalloidine (Invitrogen，美国)，海藻酸钠(Sodium alginate, SA)(国药，中国)，CaCl2(国药，中国)，荧光倒置显微镜(IX70，奥林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 细菌纤维素的水解制备

木醋杆菌接种于含果糖的培养液中，室温下静置发酵培养2周。可见白色膜状物生成并叠在一起，即为合成的BC。收集膜状物，流水清洗至无色，然后于1 mol/L的NaOH溶液中加热煮沸2 h，三级水清洗至中性。将清洗好的BC剪碎悬于水中，加入浓硫酸至64% (wt/%)，45 ℃油浴搅拌水解5 h。反应结束后用10倍水稀释反应体系终止反应体系。反复10 000 r/min离心5 min洗涤，收集沉淀合并，三级水清洗至中性，纯水重悬后备用。以三级水配置成8%(wt/%)浓度的母液，高压蒸汽灭菌20 min后备用。

1.2.2 水解细菌纤维素的电镜观察

将水解得到的细菌纤维素悬液调成0.2%的浓度，取一滴在电镜专用铜网上，放置30 s后吸水纸吸去多余的悬液，待其自然风干。滴加一滴2%的醋酸双氧铀水溶液染色1 min。吸去多余染液，自然风干后透射电镜放大33 000倍观察。拍照后根据标尺统计水解细菌纤维素的大小。

1.2.3 海藻酸钠的纯化

将海藻酸钠(SA) 1 g在4 ℃用1 mmol/L的EGTA水溶液配制成1%的溶液100 mL，搅拌均匀。使用0.45 μm规格的微孔滤膜抽滤海藻酸钠溶液。取抽滤所得滤液，在冰浴环境下缓慢滴加含有20 mmol/L NaCl 的HCl溶液(2 mol/L)，调pH至1.5，期间有大量白色不溶物生成，收集并清洗沉淀，即为难溶于水的海藻酸。海藻酸用氯仿和正丁醇体系去除杂蛋白。除蛋白后的海藻酸沉淀分散在100 mL纯水中，滴加含有20 mmol/L NaCl的NaOH溶液(2 mol/L )至中性，白色沉淀物质逐步溶解至溶液澄清无色。然后往中性溶液中加入200 mL的乙醇，快速搅拌，得大量白色絮状物沉淀，捞出45 ℃烘干即为纯化的SA。以三级水配置成10% (wt/%)浓度的母液，高压蒸汽灭菌20 min后备用。

1.2.4 MDCK细胞在支架材料上的接种和生长

MDCK细胞用含10% FBS的高糖DMEM贴壁培养，生长良好的细胞用胰酶消化吹打分散开，显微镜下细胞呈单个分布。用培养基稀释支架材料母液，配制成含不同浓度支架材料的培养液，细胞计数后与之混合，细胞密度是每200 μL 8000个。将接种了MDCK细胞的支架材料溶液以200 μL/孔平铺于24孔板中。然后以200 μL/孔将CaCl2溶液轻轻加入支架材料上方，使支架材料形成凝胶。第2天吸去上层含CaCl2的培养基，每孔补加400 μL新鲜培养基。以后每天显微镜下观察细胞生长状况，每2 d更换1次培养基。约4 d后可以看到细胞成团生长，约7 d后细胞团中部细胞凋亡形成囊腔，表现出MDCK细胞的极性特征。

1.2.5 收集MDCK细胞团拟组织及荧光染色

因为细胞团分散悬在形成的凝胶中，深浅不一，显微镜下凝胶阻碍了观察与拍照，因此将细胞团从凝胶中分离出来进行观察。将含有MDCK细胞团的凝胶用PBS吹散，收集液体，1000 r/min离心3 min，吸去上清液，重复用PBS清洗3次。4%多聚赖氨酸固定30 min，PBS清洗3次。将固定后的细胞中加入DAPI储存液，DAPI工作浓度为10 μg/mL；同时以1∶5000的比例加入Rhodamine Phalloidine，孵育2 h，然后PBS清洗3次。细胞团用PBS重悬后铺载玻片，倒置荧光显微镜或激光扫描共聚显微镜下观察，拍照。

2 结果与分析

2.1 纳米细菌纤维素形貌和MDCK三维生长状态

透射电镜观察统计，经过水解处理的细菌纤维素(BC)长度截短为600～800 nm的棒状，直径为50～150 nm(图1)。细菌纤维素与植物纤维素(Plant Cellulose)在化学组成上没有明显的区别，但BC的纤维直径更小，弹性更大，机械强度更好[9]，结晶度和重合度更高，并且组分单一[10]。一般棉花纤维的粗细在15～20 μm，而BC纤维的直径在50～150 nm[9]。一般研究文献中将醋酸杆菌产生的、粗细在200 nm以下的细菌纤维素称为纳米细菌纤维素(Nano-bacterial cellulose, nBC)[19]。本研究中水解BC纤维达到了纳米级别，在水中的悬液也具有纳米分散体系典型的流动双折射现象，可以称为纳米细菌纤维素。

图1 纳米细菌纤维素形貌

采用经典的方法在Matrigel胶中三维培养MDCK细胞[11]，即在培养小室中预先铺Matrigel，待其形成凝胶后接种MDCK细胞，细胞陷入Matrigel凝胶中进行立体生长，收集细胞团后显微镜下呈现近似球状细胞团(图2)，明显不同于贴壁时的单个细胞呈现的近似三角形或梭形。

图2 MDCK细胞在Matrigel胶中三维生长形成的细胞团

2.2 海藻酸钙凝胶培养MDCK细胞条件的初步摸索

将MDCK细胞接种于含不同浓度海藻酸钠的培养基中，与Ca离子作用形成凝胶，考察适合细胞生长的凝胶形成条件(表1)。发现在浓度为0.5%～1%的海藻酸钠与浓度3 g/L的CaCl2形成的凝胶中，细胞不会穿过凝胶掉落在培养皿底部生长，也不会因为凝胶太硬而生长不好。

表1 海藻酸钙凝胶细胞培养条件初步摸索

2.3 MDCK细胞在支架材料上的生长

根据前面初步实验结果，将海藻酸钠(SA)，Matrigel，纳米细菌纤维素(nBC)按照表2设计，用培养基分别配制成为含有不同浓度和配比的支架材料的培养液，与3 g/L的CaCl2形成的凝胶，用于MDCK细胞三维生长实验，凝胶形成后更换的新鲜培养基中不添加CaCl2。

表2 MDCK细胞在不同支架材料中三维生长状况

在SA与nBC及其组合配方的实验组中，细胞团正常生长(图3-A、B、C)，但状态不一，其中以0.5% nBC/0.5% SA、0.25% nBC/0.25% SA、0.5% nBC 和1% nBC组为优。只含SA的实验组中，MDCK细胞团生长并不旺盛。而只含有较高浓度的nBC实验组中，虽然不能形成凝胶，但由于纤维素纳米棒的自发团聚效应，nBC形成了松散的团聚物，MDCK细胞可以分散在团聚物中悬浮生长。但是nBC自发形成的团聚物由于紧实度不够，很多细胞漏出掉落在培养皿底部贴壁生长。适当浓度SA与nBC混合后形成的凝胶，既可以较好地支撑MDCK细胞三维生长，又可以有效减少细胞漏出。在显微镜下，对各团聚物分别选取3个视野计数其中形成的细胞团，发现在支架中加入Metrigel后，形成细胞团的数量增多，生长速度加快(表2)。说明Metrigel中含有的细胞外基质物质对MDCK细胞的三维生长有明显的促进作用。

如图4所示，随着培养时间的延长，MDCK细胞在nBC/SA复合材料中形成的细胞团的中部细胞出现死亡，选取不同对焦平面进行观察可见腔体中空的三维立体结构，说明MDCK细胞可以在该复合材料中进行三维培养，并自发形成腔体结构。

照片分别为可见光和DAPI染核后的荧光；A1和A2：2% SA；B1和B2：1% nBC；C1和C2：0.5% nBC/0.5% SA；D1和D2：0.5% nBC/0.5% SA/0.5% Metrigel

图4 MDCK细胞在0.5% nBC/0.5% SA复合材料中三维生长形成的腔状结构

3 讨论与结论

细菌纤维素是微生物在液态培养基中生长合成纤维素的统称，分子是葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成，生物相容性较好，降解产物没有毒性[12]，完全满足三维支架的基本条件[13]。 研究发现，细菌纤维素支架可用于软骨细胞和肌肉细胞的三维生长[14-15]；MDCK细胞在海藻酸钙凝胶支架材料中生长并不迅速，而添加一定浓度的nBC后可以提高细胞的生长。这说明在缺乏细胞外基质的情况下，多糖凝胶不能有效地支撑细胞三维生长。这种情况在比较琼脂糖、海藻酸钠、I型胶原蛋白水凝胶和Matrigel对软骨细胞三维培养效果的研究中也有发现[16]。nBC/SA复合物支持MDCK细胞三维生长较好(表2)，可能因为nBC的刚性比柔软的多糖凝胶较强，细胞与之接触诱导产生了一些胞外基质物质，促进了细胞三维生长，还有待进一步验证。

本研究所用的nBC是长度和粗细均在纳米级的纤维素，而一些研究中所说的纳米纤维指的是纤维形成的材料结构中的微孔直径是纳米级的。nBC可以通过酸水解细菌纤维素的方式获取[17-18]，水解所得纤维素的长度从几十到几百纳米不等。本研究用纳米细菌纤维素与海藻酸钠复合物作为支架材料，使得细胞被纳米材料包围，形成一种对细胞柔性的包裹，细胞在其中能够自由运动，当细胞成长时可以撑开材料从而获得生长空间。一些研究中三维支架是以微孔结构为主，细胞在微孔结构中生长分化，这种方法无法分辨细胞是真正处于三维立体生长中，还是在微孔中进行贴壁生长。由于nBC的直径和长度都在纳米级[19]，尺度远远小于细胞，因此不会出现贴壁生长现象。

大量的研究将Matrigel作为一种细胞外基质复合物加入到培养体系中，用于多种干细胞的培养和医学研究[20]。本研究在nBC/SA复合材料中添加0.5%的Matrigel(表2)，就可以明显促进MDCK细胞在材料中的三维生长，这是因为Matrigel含有的物质使其类似于组织内的胞外基质[21]。在nBC/SA复合物中添加少量Matrigel，以补充胞外基质，比完全使用Matrigel的培养方式在经济上便宜很多，在应用开发上具有一定前景。

本研究为探索纳米纤维素用于细胞三维培养复合物的研究提供了前期基础，未来的研究工作将探索纳米纤维素促进MDCK细胞三维生长的可能机制。