我国人群胃肠消化环境中土壤Pb的人体可给性

雷国龙,韩 丹,钟茂生,姜 林,彭 超

1.北京市环境保护科学研究院,北京 100037 2.首都师范大学,北京 100045 3.国家城市环境污染控制工程技术研究中心,北京 100037 4.污染场地风险模拟与修复北京市重点实验室,北京 100037

2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，铅(Pb)是主要污染物之一，点位超标率达1.5%[1].Pb会损伤神经中枢和造血系统，对儿童发育造成干扰[2-3]，是对人体有严重危害的重金属元素之一.人群主要通过经口摄入途径吸收土壤中的Pb[4-5]，传统健康风险评估方法通常假设土壤中Pb经口摄入后能够完全从土壤中解吸并进入人体胃肠液被人体吸收，之后通过血液循环系统到达靶器官并对其造成危害.但研究[6]表明，受土壤理化性质和人体消化系统微生态环境等的影响，进入人体胃肠液中的Pb并不能完全从土壤中解吸并被人体吸收.因此，基于土壤中Pb总量的传统风险评估方法会高估其健康风险.

通过测试土壤中Pb经口摄入后被人体吸收进入血液中的量(即人体有效量，该值与土壤中Pb总量的比值通常称为人体有效性)，并以此作为人体暴露剂量进行风险评估,能够有效降低传统评估方法的保守性[7].但是，目前人体有效性多采用小鼠或猪等动物活体试验进行测试[8-10]，试验周期较长、成本高、结果重现性差，且存在伦理问题，在实际工作中很难推广应用.因此，研究人员开发了多种体外模拟人体胃肠消化过程的方法，用于测试土壤中污染物经口摄入后溶于胃肠消化液的量(即人体可给量，是其能够进入人体并对健康造成危害的最大剂量，该值与土壤中污染物总量的比值通常称为人体可行性)[11]，如InVitroGastrointestinal (IVG)[12]、Physiologically Based Extraction Test (PBET)[13]、Unified Bioaccessibility Model (UBM)[14]、Simulation of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME)[15]等，这些方法的关键参数(如模拟胃肠液组分、pH、固液比、反应时间等)主要是依据西方人群胃肠消化生理特征进行确定.

因东、西方人群胃肠消化生理环境存在差异，国外已有测试方法未必能客观地表征土壤中污染物在我国人群胃肠消化道中的释放特征.我国医药领域已结合我国人群胃肠消化特征，开发了用于测定固态药剂口服后在人体胃肠液中溶解释放的体外模拟测试方法[16]，能为研究土壤中污染物在我国人群胃肠液中的释放特征及人体可给性提供参考.鉴于此，笔者以《中华人民共和国药典：一部》[17](简称“《药典》”)中记载的我国人群胃肠液组分为基础，研究土壤中Pb在模拟胃肠液中的释放特征、人体可给性以及模拟胃肠液组分、pH等参数对测试结果的影响，初步建立了基于我国人群胃肠消化特征的土壤Pb人体可给性测试方法，以期为我国人体可给性标准测试方法的制定提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试土样

从大连市某化工厂(样品编号为S1、S2、S3、S4、S5)、湖南省某冶炼厂(样品编号为S6、S7、S8、S9、S10、S11)和广西壮族自治区某尾矿下游区域(样品编号为S12、S13)共采集了13份土样.将所有土样自然风干后过2 mm尼龙筛，取部分筛下物进行样品理化特性的测定．因粒径在250 μm以下的土壤颗粒最容易通过手-口途径被人体摄入[18]，因此，剩余筛下物进一步过250 μm尼龙筛后，取筛下物用于开展人体可给性研究.

1.2 土壤理化性质

土样pH采用电位法测定；TOM(有机质)含量采用内加热重铬酸钾氧化-紫外分光光度法测定；土壤黏粒含量采用激光粒度仪Mastersizer2000(MALVERN,UK)测定；碳酸盐含量采用盐酸-氢氧化钠容量滴定法测定；TP含量采用酸溶-钼锑抗比色法测定；TPb(总铅)、TFe(总铁)、TMn(总锰)和TAl(总铝)含量采用硝酸与氢氟酸消解后使用ICP-MS(电感耦合等离子体-质谱仪，安捷伦7500a，美国)测定.供试土样理化性质见表1.

表1 供试土样理化性质Table 1 Physical and chemical parameters of soil samples

1.3 人体可给性测试

经口摄入的土壤在口腔中仅停留约15 s，其释放量可忽略，因此该研究主要关注胃肠消化阶段Pb的人体可给性及其影响因素.胃肠消化阶段Pb人体可给性测试方法主要以UBM方法为基础，胃肠消化反应时间、胃肠液pH和固液比均与UBM方法保持一致，将UBM方法中胃肠液的组分用《药典》中的胃肠液配方代替.每个样品重复两次试验，具体试验过程包括如下3个步骤.

a) 模拟胃肠液配置.胃液：取盐酸16.4 mL，加水约800 mL、胃蛋白酶(pepsin from porcine stomach,Aladdin,USA)10 g，充分摇匀后，加水稀释至1 000 mL.肠液：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使其溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，再加入胰蛋白酶(Trypsin from Bovin Pancreas,Aladdin,USA)10 g，使其完全溶解后定容至 1 000 mL.所用模拟胃肠液均在试验前1 d制备，使用前在烘箱中将其热到37 ℃.

b) 胃消化阶段人体可给性测试.取20 g待测样品置于2 L高密度聚氯乙烯瓶(HDPE)中，加入配置好的模拟胃液450 mL，混合均匀后用1.0 mol/L NaOH或37% HCl调节pH至1.1±0.2，将其放入已预热至(37±2)℃的翻转仪中翻转1 h.翻转过程中，定期测定瓶内模拟胃液pH是否为1.1±0.2，若超出此范围则滴加1.0 mol/L NaOH或37% HCl以调节pH至1.1±0.2.测试结束后，取模拟胃液15 mL至离心管，以 4 200 r/min离心10 min后取上清液，过0.45 μm醋酸纤维膜后用ICP-MS测定滤液中Pb的浓度〔ρ(GPb)〕.

c) 肠消化阶段人体可给性测试.向胃消化阶段人体可给性测试试验结束后的试验瓶中补充新鲜胃液至450 mL，同时加入1 200 mL模拟肠液，混合均匀后调节pH至6.3±0.5，之后继续翻转4 h．在翻转过程中测定模拟肠液pH是否介于6.3±0.5之间，若超出此范围需要在试验过程中向模拟胃液中滴加1.0 molL NaOH或37% HCl来调节pH至6.3±0.5.取模拟肠液15 mL至离心管中，以4 200 rmin离心10 min后取上清液，过0.45 μm醋酸纤维膜后用 ICP-MS 测定滤液中Pb的浓度〔ρ(GPb)〕.

1.4 人体可给性影响因素研究

研究[19-22]表明，人群胃肠消化环境中的消化酶、胃肠液pH等可能影响土壤中污染物的释放.我国人群胃液及肠液pH分别为0.9～1.5和7.8～8.4[23]，与国外人群胃液(1.0～4.0)及肠液(4.5～7.5)的pH环境[24]存在明显差异.因此，该研究结合我国人群胃液和肠液的pH环境，进一步选择6个供试样品研究不同胃液pH(0.7、1.0、2.0、4.0)及肠液pH(5.0、6.3、7.0、8.0)下Pb的人体可给性，以及胃肠消化液中酶对Pb人体可给性的影响，以期为基于我国人群胃肠消化特征的土壤Pb人体可给性测试方法的优化提供参考.

1.5 人体可给性浓度及人体可给性计算方法

土壤中Pb在胃肠消化阶段的人体可给性浓度及其人体可给性计算方法如下：

cg=[GPb]×vg/m

(1)

BioG=cg/cs×100%

(2)

cgi=[GIPb]×vgi/m

(3)

BioGI=cgi/cs×100%

(4)

式中：cg为胃消化阶段Pb的人体可给性浓度，mg/kg；cgi为肠消化阶段Pb的人体可给性浓度，mg/kg；[GPb]为模拟胃液中Pb的浓度，μg/L；[GIPb]为模拟肠液中Pb的浓度，μg/L；vg为模拟胃液体积，L；vgi为模拟肠液体积，L；m为测试过程中土样质量，g；cs为土样中TPb含量，mg/kg；BioG为胃消化阶段Pb的人体可给性；BioGI为肠消化阶段Pb的人体可给性.

1.6 数据统计与分析

采用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据计算，SPSS 22.0软件进行相关性分析;采用Origin 2018软件进行图形绘制.

2 结果与讨论

2.1 胃肠消化阶段人体可给性

供试土样中TPb含量为51.6～6 600 mg/kg(见表1)，其中8个土样中TPb含量超过了GB 36600—2018《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》[25]中的二类用地筛选值.人体可给性测试结果(见图1)显示，土样中Pb在胃消化阶段的人体可给性平均值为51.9%(0.4%～86.1%)，在肠消化阶段的平均值为0.6%(0.002 5%～3.1%)，与采用UBM方法对相同样品的测试结果(胃消化阶段的平均值为54.5%，肠消化阶段的平均值为0.7%)[26]无明显差异，表明采用《药典》中组分配置的模拟人体胃肠液能较好地表征土样中Pb的人体可给性.此外，该研究供试土样中Pb的人体可给性测试结果与已有研究结果相似.如LI等[27]对我国典型Pb污染地区土壤中Pb的人体可给性进行测试显示，样品中Pb在胃消化阶段的人体可给性平均值为45%(1.1%～84%)，在肠消化阶段的平均值降至2.1%；Palmer等[28]采用UBM方法对英国163个Pb污染土样进行人体可给性测试的结果显示，Pb在胃消化阶段的人体可给性中位值为40.3%(9.7%～74.6%)，在肠消化阶段的中位值为15.6%(0.3%～38.1%)；Farmer等[29]采用UBM方法对苏格兰Glasgow市土壤中Pb的人体可给性进行测试，结果显示，Pb在胃消化阶段的人体可给性平均值为52%(3%～77%)，在肠消化阶段的平均值为22%(2%～42%).

图1 胃、肠消化阶段Pb的人体可给性Fig.1 Bioaccessibility of Pb in stomach and intestine

该研究中胃消化阶段Pb的人体可给性显著高于肠消化阶段(P<0.001，n=13)，主要原因是胃消化阶段呈强酸环境(pH约为1.1)，而肠消化阶段呈偏中性环境(pH约为6.3)，在偏中性的肠道中Pb离子作为阳离子容易沉淀.如Sébastien等[30]研究发现，醋酸铅在胃消化阶段的溶解度接近100%，而在肠液中的溶解度却只有66%.此外，肠消化阶段土样中的Fe氧化物会吸附原本溶解在胃液中的Pb2+、较长的消化时间也会导致溶解的Pb2+重新被土样基质再次吸附均可导致肠消化阶段Pb的人体可给性降低.如LI等[31]通过对肠消化阶段消化后的土样残渣中Fe沉淀物进行分析，发现其吸附的Pb占溶解在胃液中Pb总量的80%～88%.Smith等[32]研究结果表明，土样中的Pb最初与铁氧化物结合，但经肠消化阶段消化后有70%的Pb与铁氧化物铁结合，其余30%均与蒙脱石结合.

2.2 土壤理化参数对人体可给性的影响

相关性分析结果显示：胃消化阶段Pb的人体可给性与土样中TOM含量呈显著正相关，但与TP含量呈显著负相关(P<0.05，n=13)；肠消化阶段Pb的人体可给性仅与土样中TAl含量呈显著正相关(P<0.05，n=13)，与TFe含量等其他土壤理化参数的相关性不明显.这与LI等[33]的研究结果相似，但与其他研究结果存在一定差异，如Walraven等[34]通过对荷兰某地区28个土样进行人体可给性及其影响因素的研究显示，土壤中Pb的人体可给性与土壤pH及有机质、黏粒、活性Fe、碳酸钙的含量均具有相关性.这可能是由该研究供试样品中部分土壤理化参数自身差异性不明显以及该试验样本量较少所致.

2.3 消化酶对人体可给性的影响

由图2可见，胃消化阶段添加胃蛋白酶与否对土样中Pb人体可给性测试结果的影响不明显，这与已有研究结论一致.如Davis等[35]研究PBET法中胃液组分对Pb人体可给性影响的结果显示，只要模拟胃液pH不变，有机酸和消化酶等组分的添加与否对Pb人体可给性的影响均不显著.LI等[36]研究表明，PBET方法中是否加入胃蛋白酶对土壤中Pb在胃消化阶段的人体可给性影响不明显.因此，采用《药典》中模拟人体胃肠液组分的方法测试土样中Pb在胃消化阶段的人体可给性时，可不添加胃蛋白酶，以降低测试成本.

在肠消化阶段，除供试样品S1外，不添加胰蛋白酶均可降低其他土样中Pb的人体可给性.主要原因是，肠消化阶段Pb2+能完全置换出胰蛋白酶中的Ca2+而结合到胰蛋白酶上，促进了土样中Pb2+向肠液中溶解，最终导致其人体可给性升高[37].因此，如需区分土样中Pb在胃和肠消化阶段的人体可给性以进行更精细的健康风险评估，应在测试土样中Pb在肠消化阶段的人体可给性过程中加入胰蛋白酶.

2.4 模拟胃肠液pH对人体可给性影响

不同pH环境下的人体可给性测试结果(见图3)显示，总体上随着模拟胃液pH的升高，土样中Pb的人体可给性呈降低趋势，与已有研究结论一致.例如，YANG等[38]研究显示，将胃消化阶段pH控制在1.5～4范围内，Pb的人体可给性随模拟胃液pH的升高而降低；吴小飞等[39-40]研究显示，胃消化阶段Pb的人体可给性与胃液pH呈线性负相关.究其原因主要是，在一定范围内随着pH的升高，重金属容易形成较稳定的不溶性氢氧化物，导致Pb在胃消化阶段的人体可给性随之降低[41].进一步对该研究胃消化阶段样品中Pb的人体可给性测试结果与采用UBM方法对该研究中所用土样进行胃消化阶段Pb的人体可给性测试结果[26]进行对比(见图4)，发现二者差异性不明显.由于该研究所用方法中胃消化阶段的pH与UBM方法中一致，二者仅模拟胃液组分存在差异，因此，可推测pH是控制土样中Pb在胃消化阶段人体可给性的关键参数.Oomen等[42]通过比较采用5种常用人体可给性测试方法测试的同一批供试土样中Pb的人体可给性结果发现，造成胃消化阶段Pb的人体可给性差异性的主要原因是各方法间模拟胃液的pH不同，这也进一步证实了上述推测.

图4 基于UBM方法与《药典》方法的胃消化阶段Pb人体可给性结果比较Fig.4 Comparison of bioaccessibility in gastric measured by the UBM and medical formula

对该研究结果进行统计检验显示，在pH=0.7和pH=1.0的胃消化环境下土样中Pb的人体可给性无显著差异(P>0.05，n=6)，而在pH=1.0和pH=2.0的模拟消化环境下Pb的人体可给性差异明显(P<0.05，n=6).考虑到我国人群胃液pH范围一般在0.9～1.5之间，因此，采用《药典》中推荐的胃液配方，选择pH=1.0的模拟环境能够表征土壤中Pb在我国人群胃消化阶段的释放特征.

肠消化阶段Pb的人体可给性随pH的变化趋势(见图5)显示，模拟肠液pH在5～8范围内变化时，土样中Pb人体可给性变化不显著，与已有研究结果类似.例如，付瑾等[43]研究显示，肠消化阶段pH控制在6～8时土壤中Pb的人体可给性无显著差异；YANG等[38]研究显示，使用0.1 mol/L NaNO3对土样中Pb进行浸提，当浸提液pH控制在5～12范围内时，随着浸提液pH的升高，Pb浸出量变化不显著.究其原因，主要是在碱性环境下Pb主要受土壤中其他金属所形成的氢氧化物的吸附控制，在溶液中其浓度相对较低，导致其变化幅度较小.我国人群肠消化阶段典型pH范围为7.8～8.4，偏碱性，结合该研究结果可知，采用《药典》中推荐的肠液配方，选择pH=8.0的肠消化环境能够表征土壤中Pb在我国人群肠消化阶段的释放特征.

图5 供试土样模拟肠消化阶段Pb的人体可给性随pH的变化情况Fig.5 Bioaccessibility of Pb with different pH values of intestine

3 结论

a) 采用《药典》中推荐的我国人体胃、肠液组分配置的模拟消化液测试土样中Pb在胃消化阶段的人体可给性(平均值为51.9%)显著高于肠消化阶段的人体可给性(平均值为0.6%)，与采用目前国际上常用的UBM方法测试结果无明显差异，可用于测试土样中Pb的人体可给性.

b) 模拟胃液的pH是影响土样中Pb在胃消化阶段人体可给性测试结果的关键参数，测试过程中宜将体系pH维持在1.0左右，且可将《药典》中推荐的模拟胃液组分进一步优化为HCl和去离子水，以降低测试成本.模拟肠液应严格按《药典》推荐的组分进行配置，测试体系的pH宜维持在8.0附近.