瘤胃微生物强化醋糟厌氧消化及其机制

李 倩，许之扬，周云龙，何 迪，白 玲，晏习鹏，阮文权*

1.江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122 2.江苏省环境厌氧生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122

醋糟是麸皮、稻壳等辅料与高粱、糯米等主料经固态发酵后剩余的残渣，其主要成分为木质纤维素(纤维素、半纤维素和木质素)[1]，产量巨大.厌氧消化是实现醋糟资源化和减量化的重要途径[2]，然而木质纤维素高度复杂和稳定的聚合结构极大地限制了醋糟厌氧消化效率[3].因此，强化木质纤维素的水解是提高醋糟厌氧消化性能的关键.

关于提高木质纤维素水解效率的研究主要归为两类[4]：①通过化学、物理和生物等预处理方法，破坏木质纤维素的致密结构；②通过接种高效水解菌，生物强化厌氧体系中的木质纤维素水解过程.前者虽能有效地改善木质纤维素的水解效率，但很难避免处理过程中造成的二次污染以及实际应用中的高成本等问题；相比之下，后者因无二次污染、工作量小、成本低等优势正被广泛关注.反刍动物的瘤胃被称为天然纤维物质的转换器，其中含有的产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、黄色瘤胃球菌属(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌属(Ruminococcusalbus)和栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)都是公认的木质纤维素降解优势菌[5-7].HU等[8]在玉米秸秆厌氧批次试验中发现，瘤胃微生物要比传统的厌氧污泥表现出更高的水解和酸化效率，可多产生28%的挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs).虽然瘤胃微生物对木质纤维素能表现出更快和更好的降解潜能，但由于其中只含有少量产甲烷菌[9]，因此常采用两相消化工艺(分离水解相和产甲烷相)来研究瘤胃微生物对木质纤维素类底物的水解强化.例如，ZHANG等[10]采用两相消化工艺，将瘤胃液水解后的稻秸用于产甲烷，最终单位质量底物甲烷产量达285 mL/g(以VS计)，是未经瘤胃液处理的对照组的1.9倍.虽然两相消化工艺效果显著，但在实际运行过程中很难实现水解相和产甲烷相的严格分开，且该方法工作量大，难以大规模应用[11].因此，若能在同一相中实现水解和产甲烷，无疑对瘤胃微生物强化醋糟水解的实际应用具有重要意义.

已有关于瘤胃生物强化的研究大多停留在厌氧消化效能评估的层面，且微生物对环境变化较为敏感，因此有必要深入探究生物强化过程中的菌群变化，揭示瘤胃微生物强化的机理.基于16S rRNA的研究方法常被用于定性分析厌氧体系中微生物多样性，但木纤维素降解功能与微生物多样性并非密切相关[12].相比之下，微生物定量分析对于深入探究厌氧体系强化机制更具意义.检测编码木质纤维素降解蛋白基因则是实现微生物定量的重要手段之一，该方法能直接提供有效的代谢功能信息[7].厌氧环境中，木质纤维素降解菌主要分布于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase family，GH5)、GH9和GH48中[13].其中，GH5为最大的糖苷水解酶家族之一[14]，与木质纤维素的降解效果密切相关.因此，GH5水解基因的定量结果可用于表征瘤胃强化体系的木质纤维素水解效果.

针对前期工作中醋糟厌氧消化木质纤维素利用率低的问题[15]，该研究采用瘤胃微生物为接种物，以前期工作确定的最高有机负荷为起始有机负荷，在25 L的卧式厌氧反应器中进行连续式运行，通过逐步提升反应体系有机负荷来考察瘤胃强化体系物料处理能力的提升效果，分析各有机负荷下底物的降解规律，并通过定量分析关键水解菌群，深入研究瘤胃微生物强化木质纤维素水解机制，以期为该方法的工业化应用提供数据和理论支撑.

1 材料与方法

1.1 底物与接种物

醋糟由江苏省镇江市某食醋生产企业提供，存于冰箱备用.厌氧污泥为前期工作中醋糟厌氧体系中的厌氧消化污泥[15]，瘤胃污泥为实验室长期处理秸秆产气效果良好的瘤胃污泥.厌氧污泥和瘤胃污泥基于TS(总固体)含量按3∶2的比例混合，取25 L混合污泥接种于反应器中.醋糟和接种物的主要参数见表1.

表1 醋糟和接种物的性质Table 1 Characteristics of vinegar residue and inocula

1.2 反应装置和试验设计

为保证进出料和沼液的均质化，试验选用体积为30 L的卧式反应器，其有效工作体积为25 L，反应器装置如图1所示.反应器上部设有进料口、出气口和视镜，下部设有出料口，进出料采用螺带式输送.出气口与湿式气体流量计(LMF-1，长春汽车滤清器有限公司)和便携式红外沼气分析仪(Gasboard-3200L，武汉立方光电有限公司)相连，分别用于测定产气量和甲烷含量.将从出料口排出的消化液进行固液分离，沼渣烘干用于组分分析，沼液补水回流至反应器.

图1 卧式厌氧消化反应器Fig.1 Horizontal anaerobic digestion reactor

反应器共运行6个阶段，各阶段具体运行参数见表2，其中，P1阶段对应的有机负荷为前期工作中醋糟厌氧体系的最高有机负荷.厌氧消化温度控制在(37±1)℃，采用间歇式搅拌，搅拌速率为4 r/min，体系的含固率为14%±1%.每天定时进料，每2 d出料一次，留样并测定相关指标.

表2 各阶段运行参数Table 2 Operation parameters of each stage

1.3 测定参数及方法

总固体(TS)和挥发性固体(VS)含量采用干重法测定[16]；C和N元素含量采用元素分析仪(Vario MICRO cube，德国Elementar公司)测定；粗蛋白含量为凯氏定氮仪(KDN-520，杭州绿博仪器有限公司)测得的凯氏氮含量乘以6.25[17]；对于纤维素、半纤维素和木质素含量，将沼渣于50 ℃下烘干至恒质量，采用范式洗涤法[18]，利用纤维素分析仪(ANKOM 2000i，美国ANKOM公司)测定；对于氨氮和VFAs含量，将沼液以 12 000 r/min离心15 min，用蒸馏水稀释上清液，分别采用纳氏试剂分光光度法[16]和总量比色法[19]进行测定；pH采用pH计(Delta320，瑞士Mettler Toledo公司)进行测定；TS和木质纤维素降解率计算方法见式(1).

D=(Min-Mout-Macc)/Min×100%

(1)

式中：D为TS、纤维素、半纤维素或木质素的降解率，%；Min为各阶段内添加至体系中TS、纤维素、半纤维素或木质素的总质量，g；Mout为各阶段内排出体系的TS、纤维素、半纤维素或木质素的总质量，g；Macc为各阶段内体系中TS、纤维素、半纤维素或木质素的总质量，g.

1.4 GH5绝对定量实时聚合酶链锁反应(Q-PCR)

a) 提取DNA.每个泥样用0.85%的盐水洗涤3次，去除其中的腐殖质[20].按照DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN，德国)的说明书提取DNA，用超微量分光光度计(BioDrop DUO，英国Biochrom公司)检测DNA模板的浓度和纯度，置于-20 ℃下保存.

b) 构建质粒.GH5的特异性引物cel5_392F和cel5_754R[13]〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕按照表3所示的程序扩增目的基因.扩增体系包括：PCR Master Mix(2×)〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕12.5 μL，正、反引物和DNA模板各1 μL以及9.5 μL ddH2O(双蒸水)〔宝生物工程(大连)有限公司〕，在MJ MiniTMPCR扩增仪(MJ Mini，美国Bio-Rad 公司)上进行反应.PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，切割目的条带，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕回收纯化PCR产物.纯化产物与载体pMD19-T〔宝生物工程(大连)有限公司〕连接，热击将其导入到大肠杆菌感受态细胞JM109〔宝生物工程(大连)有限公司〕，LB培养基平板涂布培养12 h，随机挑取白色菌落进行液体扩培，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕提取质粒，并通过PCR验证阳性质粒.

c) 建立标准曲线.将阳性质粒按10倍梯度(1010～104)稀释作为标准品，每个标准品和样品做3个平行.绝对Q-PCR的25 μL反应体系包括：TBTMPremix Ex TaqTMⅡ(宝生物工程有限公司，大连)12.5 μL，正、反引物和模板DNA各1 μL以及9.5 μL ddH2O.绝对Q-PCR使用实时定量PCR仪(Rotor-Gene Q，德国Qiagen公司)，扩增程序如表3所示.绘制GH5的定量标准曲线，基于循环阈值Ct(cycle threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)可计算出每个样品中GH5基因拷贝数.

表3 绝对Q-PCR的引物序列及扩增程序Table 3 Primer sequences and amplification program of absolute Q-PCR

2 结果与讨论

2.1 产气变化情况

如图2所示，P1～P6阶段单位质量底物沼气产量分别为422、434、446、437、451和352 mL/g(以VS计),相应的单位质量底物甲烷产量分别为242、247、255、248、261和183 mL/g(以VS计).沼气中甲烷含量变幅较小，维持在55%左右.单位质量底物产气逐渐升高并保持在较高水平(除P6阶段外)，可以看出，瘤胃强化体系在有机负荷提升过程中逐渐展现出其优良的产甲烷性能.有机负荷提升初期，底物对瘤胃强化体系中微生物的冲击作用导致产气短暂性下降[15]；随着微生物逐渐适应新的有机负荷，产气恢复直至稳定.当有机负荷升至P6阶段水平时，单位质量底物沼气和甲烷产量均降至较低水平，此时运行时间满32 d(该有机负荷下的物料停留时间)，说明瘤胃强化体系对该有机负荷强度下出现了明显的不适应，物料处理能力显著降低.该瘤胃强化体系共运行131 d，P1～P5阶段运行至单位质量底物产气量稳定所需的运行时间呈下降趋势，分别为28、22、16、16和18 d，说明瘤胃微生物与原体系菌群之间逐渐形成稳定的协同效应，对底物的适应能力不断增强.

图2 有机负荷提升过程中单位底物沼气和甲烷产量的变化Fig.2 Changes of biogas and methane production per unit substrate with the increase of organic loading rates

有机负荷和单位质量底物产气是研究醋糟厌氧消化最基本的参数[21].由于醋糟中木质纤维素的难降解性，前期工作获得的最高有机负荷只有5.83 g/(L·d)，单位质量底物沼气和甲烷产量分别为418和223 mL/g[15].经瘤胃微生物强化之后，瘤胃强化体系的最高有机负荷达8.90 g/(L·d)时，处理能力是原体系处理能力的1.53倍，相应的单位质量底物沼气和甲烷产量更是高达451和261 mL/g，与原体系产气相比分别提升了7.89%和17.8%.显然，无论是有机负荷还是单位质量底物产气量，瘤胃强化后的厌氧消化体系对醋糟的处理能力都显著提升.综上，醋糟厌氧体系经瘤胃微生物强化之后，表现出了更佳的单位质量底物产气和处理能力，显著提升了醋糟的资源化利用效率.

2.2 发酵环境稳定性分析

发酵环境的稳定是影响厌氧体系沼气产率的关键因素之一.VFAs、氨氮浓度和pH的变化都会影响微生物活性，进而影响厌氧消化效率，所以VFAs、氨氮浓度和pH被认为是重要的厌氧消化系统稳定性指标[22-23].

如图3(a)(b)所示，在连续运行过程中，氨氮和VFAs浓度有着相同的变化趋势，即先升后降.有机负荷提升初期，水解微生物快速利用底物，导致VFAs浓度升高，积累的VFAs随着体系产甲烷活性的逐渐增强而被利用，这与2.1节得到的产气结果一致.同时，醋糟中的蛋白质以及因底物冲击消亡的微生物体被分解释放出氨氮，随着微生物的合成，积累的氨氮的代谢速率提高而逐渐被消耗.随着反应器的连续运行，VFAs浓度的波动幅度逐渐减缓，VFAs的消耗速率与生成速率很快达到平衡，说明连续的底物刺激促使了瘤胃微生物与原厌氧菌群逐渐形成稳定的菌群关系，体系的稳定性增强.P1～P5阶段，VFAs的最终浓度分别为2.28、2.62、2.29、1.96和1.85 g/L，虽然VFAs的最终浓度处于下降趋势，但单位质量底物产气量始终处于高水平(见2.1节)，说明体系中的水解产物VFAs能被产甲烷菌高效转化为沼气；而P6阶段，VFAs浓度由1.85 g/L降至1.54 g/L，纤维素和半纤维素的低降解率(见2.3节)是VFAs浓度降低的直接原因.P6阶段氨氮浓度持续降低，可能是因为体系对蛋白质的水解能力达到饱和状态，醋糟中的蛋白质未被充分降解利用.

图3 有机负荷提升过程中VFAs、氨氮浓度和pH的变化Fig.3 Changes of VFAs,ammonia nitrogen concentration and pH with the increase of organic loading rates

从图3(c)可以看出，在氨氮和VFAs的共同作用下，体系的pH维持在7.0～7.5之间.虽然有机负荷提升初期出现了VFAs积累的情况，但体系并未发生酸化，这是因为氨氮可以提供充足的碱度[23-24]，且氨氮和VFAs浓度相同的变化趋势更有助于维持厌氧消化体系内的酸碱平衡.厌氧消化体系中，水解菌和产甲烷菌生长的最适pH范围分别为5.3～8.3和6.5～8.2[22,25]，稳定且弱碱性的发酵环境对原体系厌氧菌群和瘤胃微生物的代谢活动及稳定菌群关系的建立都具有积极影响.

2.3 底物降解特性

TS降解率是表征醋糟中被厌氧菌群利用干物质量的重要指标.如图4所示，P1～P6各运行阶段的TS降解率分别为51.2%、52.9%、54.1%、53.2%、54.9%和49.1%.TS降解率与体系单位质量底物产气情况变化趋势一致.除P6阶段外，其余5个阶段TS降解率均呈逐渐升高趋势，表明接种了瘤胃微生物的新厌氧消化体系逐渐稳定，水解效能优势逐渐展现.

图4 各运行阶段TS和木质纤维素降解率的变化Fig.4 TS and lignocellulose degradation efficiencies of each operation stage

木质纤维素作为醋糟的主要成分，其降解效果对醋糟的厌氧消化性能有重要影响，所以将各阶段半纤维素、纤维素和木质素的降解情况逐一分析，能进一步解释瘤胃微生物对木质纤维素水解强化的效果.P1～P6各阶段半纤维素降解率分别为68.1%、71.5%、73.6%、75.8%、73.9%和65.1%；相应的纤维素降解率分别为42.3%、40.9%、39.8%、38.2%、40.1%和34.6%.木质纤维素的降解效果几乎全部由纤维素和半纤维素贡献，纤维素和半纤维素的高降解率是底物高利用率的主要原因.结合水解微生物定量分析(见2.5节)得出，木质纤维素水解微生物的逐渐富集是木质纤维素被高效利用的根本原因.其中，由于半纤维素分子量较小[26]、更容易被水解利用的特性，所以半纤维素的降解率更高，对木质纤维素降解的贡献更大.随着有机负荷的提升，半纤维素降解率逐渐提高，在P4阶段半纤维素降解率达到最高(75.75%).由于纤维素的高结晶度以及木质素对纤维素酶的物理屏障和无效吸附[27]，纤维素降解率显著低于半纤维素降解率，且随有机负荷的提升呈下降趋势.虽然木质素被公认为在厌氧环境下无法被利用[28]，但是有研究指出木质素可以被瘤胃微生物少量降解[29-30].P1～P6各运行阶段，体系木质素降解率分别为17.4%、16.3%、15.4%、18.1%、17.8%和12.4%，表明瘤胃微生物与原微生物体系可有效融合，并发挥其木质纤维素水解功能.P6阶段，纤维素和半纤维素的降解率均降低，这与VFAs浓度和单位质量底物产气降低结果(见2.1和2.2节)相符.综上，通过长期的连续运行，瘤胃微生物展现出水解效能优势，成功塑造了高效的木质纤维素瘤胃强化体系.

2.4 微生物定量解析瘤胃水解强化机制

在厌氧消化效能评估的基础上深入探究生物强化过程中目标微生物量的变化，对揭示瘤胃微生物强化的机理具有重要意义.定量检测编码木质纤维素降解蛋白基因是研究体系水解情况的重要手段.在厌氧消化过程中，降解木质纤维素的糖苷水解家族主要分布于GH5、GH9和GH48中，其中GH5水解家族分布最为广泛，与木质纤维素的降解效率呈正相关，瘤胃微生物如拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)等都含有GH5基因[12].因此，该研究利用GH5水解酶基因表征厌氧消化过程中瘤胃强化体系中关键水解菌群的变化情况.

如图5(a)所示，以阳性质粒的基因拷贝数的对数为纵坐标(Y)、Ct值为横坐标(X)，则水解家族GH5的定量标准曲线为Y=11.313-0.237X，决定系数R2(coefficient of determination)为 0.996 55(>0.99).如图5(b)所示，P1阶段GH5基因拷贝数由最初的9.64×1010copies/g升至2.26×1011copies/g，然后持续降至最终的1.25×1011copies/g.这是因为前期不断加入的底物为微生物提供了大量营养物质，水解微生物快速增殖；但又因一部分接种的瘤胃微生物无法适应新的厌氧环境而从体系中消失[31].P1阶段最终的基因拷贝数为最初拷贝数的1.30倍，说明部分来自瘤胃的微生物能适应新的厌氧环境，并以一定的规模稳定地存在于新的微生物体系中.P2阶段初期，水解微生物因底物冲击而短暂降至6.56×1010copies/g，然后逐渐升至9.64×1011copies/g.经过长期连续运行和底物刺激之后，P1～P6各运行阶段GH5水解家族的最终基因拷贝数不断升高，分别为1.25×1011、2.06×1011、3.07×1011、5.32×1011、6.83×1011和4.66×1011copies/g，分别是初始GH5基因拷贝数的1.30、2.14、3.18、5.52、7.09和4.83倍.结合2.3节底物降解分析可以看出，P1～P5阶段内GH5大量富集，而底物降解率却保持在相对稳定的范围内，这是因为，P1～P5阶段物料停留时间由52 d降至34 d，意味着底物和微生物的接触时间缩短，单位微生物在单位时间内的底物降解量随之减少.然而，GH5富集使得单位时间内有更多的微生物参与底物降解，因而弥补了因物料停留时间缩短所导致的底物量降解量减少.高有机负荷下，木质纤维素水解中间产物在低物料停留时间下无法被及时利用而逐渐富集，中间产物如纤维素低聚糖、琥珀酸等都是反馈抑制剂[32].因而，P6阶段GH5水解菌群因受到抑制而无法继续富集，GH5基因拷贝数由6.83×1011copies/g降至4.66×1011copies/g，低生物量和低物料停留时间的共同作用使得P6阶段底物降解率显著降低(见2.4节).底物降解效率的降低使得体系含固率升高，沼液黏性增加，弱化了体系的传质效果，导致体系底物降解效果进一步降低.综上，GH5水解微生物的富集是瘤胃强化体系底物处理能力提升和在低物料停留时间下底物被高效降解的根本原因.

图5 GH5的标准曲线和厌氧消化过程中GH5的基因拷贝数变化Fig.5 Standard curve of GH5 and changes of GH5 gene copies during anaerobic digestion

3 结论

a) 通过接种瘤胃微生物强化木质纤维素水解，醋糟厌氧发酵体系有机负荷升至8.90 g/(L·d)(以VS计)，相应的单位质量底物沼气和甲烷产量分别为451和261 mL/g(以VS计)，相较于强化前其处理能力提升了1.53倍.这表明瘤胃微生物的介入可有效强化体系底物的降解能力，进而促进产甲烷性能的提升.

b) 半纤维素和纤维素的高降解率是瘤胃强化体系单位质量底物产气提升的主要原因，最佳有机负荷〔8.90 g/(L·d)〕下，纤维素和半纤维素的降解率分别为73.9%、40.1%.这说明经过连续的底物刺激，瘤胃微生物发挥出其木质纤维素水解优势，成功塑造了高效的瘤胃水解强化体系.

c) 随着有机负荷的提升，与木质纤维素水解密切相关的瘤胃微生物逐渐适应醋糟厌氧消化体系并持续富集，其基因拷贝数从9.64×1010copies/g升至最高有机负荷阶段的6.83×1011copies/g，提高了6.09倍，这是醋糟厌氧消化体系通过瘤胃微生物强化后底物水解效率和厌氧消化效率显著提升的根本原因.