石灰组配有机改良剂对农田铅镉污染土壤微生物活性的影响

曾秀君，黄学平，程 坤，何国庆，傅志强，赵雪莹

南昌工程学院,江西 南昌 330099

土壤是生态系统的重要组成部分，也是人类和其他生物生存的物质基础.近年来，随着采矿和冶炼业的迅速发展、农药化肥等在农业活动中的广泛应用，我国面临农田土壤重金属污染的重大挑战，其中尤以铅(Pb)、镉(Cd)污染较为严重.土壤中重金属的积累不仅会导致作物产量减少、质量下降，还会通过食物链危害人体健康[1-2].因此，采取安全有效的措施修复土壤重金属污染是当前亟待解决的环境和社会问题.

在众多土壤修复材料中，石灰是传统的土壤改良剂.国内外研究[3-6]表明，石灰对单一Cd污染土壤具有良好的修复效果.高译丹等[3]研究发现，在Cd污染草甸土中施加石灰可显著降低土壤可交换态Cd含量，较对照降低了17.8%～21.7%.Woldetsadik等[4-6]研究显示，施用石灰可显著提高土壤pH，降低土壤中有效态Cd含量.而对于复合污染土壤，石灰钝化修复往往达不到理想效果[7]，且长期施用石灰容易导致土壤板结，因而石灰配施其他廉价有效改良剂对治理农田复合污染土壤提供了新的途径[7-8].生物质炭比表面积大，孔隙率高，具有强大的吸附能力和离子交换能力，能有效降低土壤中重金属的生物有效性[9-10].Lahori等[11]研究表明，施用石灰及烟草生物质炭可减少土壤中DTPA (diethylene triamine pentaacetic acid，二乙三胺五乙酸)提取态Pb、Cu、Cd含量，降低植物中重金属含量.腐殖酸是一种优质的两性物质，其施入土壤不仅能促进土壤微生物活动，改善土壤结构[12]，还能与重金属污染物发生作用，从而减缓土壤中重金属的有效性[13].吴烈善等[14]通过单施及复配探讨腐殖质、石灰等4种不同改良剂对污染土壤中重金属的钝化效果，发现单一改良剂中以2%石灰稳定效果最好；复配改良剂中以2%腐殖质+2%石灰稳定效果最佳，Pb、Cu、Cd和Zn稳定效率分别达98.49%、99.40%、95.86%和99.21%.

土壤微生物是维持土壤质量的重要组成成分，其中土壤基础呼吸、土壤微生物生物量和土壤酶活性等对土壤中外来异生物质反应灵敏，在一定程度上能较早反映土壤的受污染程度[15-16].因此，可从土壤微生物的变化情况来研究组配改良剂对重金属污染土壤的作用，指示其对重金属污染土壤的修复效果.然而，国内外农田重金属污染土壤中施加组配改良剂对土壤微生物环境变化规律的研究较为鲜见.该研究通过在农田污染土壤种植黑麦草以及施用石灰组配改良剂，研究其对土壤有效态重金属Pb、Cd含量以及土壤基础呼吸强度、土壤微生物生物量碳含量和土壤酶活性等影响，探讨改良剂与农田Pb、Cd污染以及土壤生物学指标的内在联系，以期为改良剂修复重金属污染土壤提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自广东省仁化县某大型冶炼厂(113°39′04″E、25°05′59″N)周边农田污染土壤，类型为砂质壤土.土壤取样深度为0～20 cm，鲜土采集后剔除石块、动物及植物根茬等杂物后过2 mm筛，充分混匀，在4 ℃下保存备用.土壤基本理化性质：pH为5.1；有机质含量为28.9 g/kg；全氮含量为1.6 g/kg，碱解氮含量为127.0 mg/kg；全磷含量为0.365 g/kg，速效磷含量为17.769 mg/kg；全钾含量为9.13 g/kg，有效钾含量为46 mg/kg；Pb含量为214.68 mg/kg，Cd含量为1.26 mg/kg，除Pb、Cd外，其他重金属含量均在GB 15618—2018《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准》农用地土壤污染风险筛选值内.

供试植物为南方多年生黑麦草，种子购于上海天成草业服务有限公司.

供试改良剂：石灰，其pH为12.1，Pb含量为2.78 mg/kg，Cd含量为0.12 mg/kg，研磨后过0.25 mm筛；腐殖酸，其pH为4.5，Pb、Cd未检测出，研磨后过0.25 mm筛；生物质炭，其pH为10.5，Pb、Cd未检测出，含碳量为35%，研磨后过0.25 mm筛.

1.2 试验设计与处理

试验共设置7个处理组，分别为CK (对照组，不施加改良剂)、T1(0.2%石灰+1%腐殖酸)、T2(0.2%石灰+2%腐殖酸)、T3(0.2%石灰+5%腐殖酸)、T4(0.2%石灰+1%生物质炭)、T5(0.2%石灰+2%生物质炭)、T6(0.2%石灰+5%生物质炭)，各处理设置4次重复.

试验于2018年9月10日开始，供试土壤与试验设置剂量改良剂充分混匀后装盆，每盆装土500 g(盆直径11.1 cm、高10.8 cm)，浇水至土壤田间持水量的70%左右，平衡一周后，每盆均匀撒入南方多年生黑麦草种子50粒，放置于室内培养架上，每天光照与黑暗各12 h，控制温度范围为20～35 ℃，待种子出苗后，每盆定苗30株，并按农田土壤最佳施肥量(按氮计算)——300 kg/hm2〔光照强度为120 μmol/(m2/s)〕将水溶性肥料稀释后施于土壤中，期间根据每盆土壤水分状况称重浇水，使盆栽土壤含水率为土壤饱和含水率的70%左右，于播种后的第30天和第60天进行破坏性采样.

1.3 分析方法

土壤重金属总量采用HNO3-HClO4(二者体积比为4∶1)消煮，土壤有效态Pb、Cd含量用0.01 mol/L CaCl2浸提，用电感耦合等离子体质谱仪(Agilent 7700X，美国)测定Pb、Cd浓度，同时每批样做空白试验.样品分析过程中采用国家标准样品(GSB 04-1742-2004、GSB 04-1721-2004)进行质量控制.标样回收率范围为88%～103%.土壤基础呼吸采用碱吸收法测定[17]；土壤微生物量碳采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提测定[18]；脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，FDA (Fluorescein Diacetate,荧光素二乙酸酯)水解酶活性采用优化的荧光素二乙酸脂水解方法测定，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定[19].

1.4 数据处理

试验数据均使用Microsoft Excel 2013软件进行分析，使用SPSS 19.0软件进行Pearson相关性分析，采用方差分析和多重比较(Duncan检验)法分析不同处理数据间的显著性差异(p<0.05)，使用Origin 9.0软件进行绘图.

2 结果与分析

2.1 土壤有效态Pb、Cd含量

培养60 d时，不同组配改良剂处理对土壤有效态Pb、Cd含量的影响如图1所示.由图1可见：与CK相比，不同组配改良剂处理的土壤有效态Pb含量均呈显著降低趋势.其中，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)土壤有效态Pb含量较CK分别显著降低了84.33%、89.24%和89.45%，T2和T3处理组之间差异不显著；石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)土壤有效态Pb含量较CK分别显著降低了91.05%、95.91%和96.30%，T5和T6处理组之间差异不显著.与CK相比，不同组配改良剂处理的土壤有效态Cd含量均呈显著降低趋势.其中，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)土壤有效态Cd含量较CK分别显著降低了92.98%、92.75%和89.63%，而T1和T2处理组之间差异不显著；石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)土壤有效态Cd含量较CK分别显著降低了94.09%、96.77%和98.10%，各处理组间差异不显著.

注：不同字母表示处理组间存在显著差异(p<0.05)，下同.图1 不同处理对土壤有效态Pb、Cd含量的影响Fig.1 Effects of different treatments on soil available Pb and Cd content

2.2 土壤基础呼吸强度的动态变化

由图2可见，随着培养时间的延长土壤基础呼吸强度总体呈升高趋势，且不同组配改良剂均能不同程度地增加土壤基础呼吸强度，其中石灰配施生物质炭处理对土壤基础呼吸强度的增加效果优于石灰配施腐殖酸处理.第30天时，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)中土壤基础呼吸强度随配施腐殖酸剂量的增大而逐渐降低，其中配施1%腐殖酸处理组(T1)的土壤基础呼吸强度为0.117 mg/(g·d)，较CK增加了65.14%；而石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的土壤基础呼吸强度较CK分别增加了87.68%、128.52%和126.41%.第60天时，各处理组土壤基础呼吸强度具体表现为T5>T6>T4>T1>T3>T2>CK.与CK相比，石灰配施1%腐殖酸处理组(T1)的土壤基础呼吸强度增加了136.12%，石灰配施2%生物质炭处理组(T5)的土壤基础呼吸强度增加了223.28%.

图2 不同处理对土壤基础呼吸强度的影响Fig.2 Effects of different treatments on soil basal respiration rate

2.3 土壤微生物量碳含量的动态变化

由图3可见：在培养期间内，各处理组土壤微生物量碳含量随培养时间的增加呈显著上升的趋势.第30天时，除T1处理组外，其他处理组(T2～T6)土壤微生物量碳含量均高于CK，其中，石灰配施2%腐殖酸处理组(T2)较CK增加了35.56%，石灰配施5%生物质炭处理组(T6)较CK增加了34.87%，且2个处理组间差异不显著；第60天时，与CK相比，各组配改良剂处理组均能不同程度地增加土壤微生物量碳含量，其中，石灰配施腐殖酸处理组的土壤微生物量碳含量随配施腐殖酸剂量的增大而增加，以石灰配施5%腐殖酸处理组(T3)的增幅(26.64%)最大，石灰配施生物质炭处理组的土壤微生物量碳含量较CK增加了1.12%～8.63%.

图3 不同处理对土壤微生物量碳含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on soil microbial biomass carbon content

2.4 土壤微生物代谢熵的动态变化

代谢熵(qCO2)是土壤基础呼吸强度和微生物量碳含量的比值.由图4可见：在培养期内各处理组土壤微生物代谢熵范围为0.14～0.47.第30天时，石灰配施腐殖酸的T1处理组的土壤微生物代谢熵较CK显著增加了98.55%，T2和T3处理组的微生物代谢熵均与CK无显著差异；石灰配施生物质炭处理组的土壤微生物代谢熵均显著高于CK，且随配施生物质炭剂量的增大土壤微生物代谢熵呈先升后降的趋势，配施2%生物质炭处理组(T5)的代谢熵最大，较CK增加了107.70%.第60天时，与CK相比，组配改良剂处理组均能显著增加土壤微生物代谢熵，且石灰配施生物质炭处理组的增幅高于石灰配施腐殖酸处理组，以石灰配施2%生物质炭处理组的增幅(211.25%)最大.

图4 不同处理对微生物代谢熵的影响Fig.4 Effects of different treatments on soil microbial quotient

2.5 土壤酶活性的动态变化

由图5可见：随着培养时间的延长，土壤脲酶活性总体呈显著上升的趋势.第30天时，除T3处理组的土壤脲酶活性与CK无显著差异外，其他各处理均显著高于CK，其中石灰配施1%和2%腐殖酸处理组(T1和T2)的土壤脲酶活性较CK分别增加了36.29%和19.09%，而石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的土壤脲酶活性较CK分别增加了26.91%、40.17%和38.84%，各处理间差异不显著；第60天时，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)的土壤脲酶活性与CK无显著差异，而石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)均显著高于CK，增幅范围为32.79%～47.42%.

图5 不同处理对土壤脲酶活性的影响Fig.5 Effects of different treatments on soil urease activity

由图6可见，随培养时间的延长，土壤FDA水解酶活性大体呈下降趋势.第30天时，石灰配施腐殖酸处理组(T1和T2)的土壤FDA水解酶活性与CK无显著差异，而T3处理组的FDA水解酶活性较CK显著增加了29.38%；石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的土壤FDA水解酶活性均显著低于CK，降幅范围为17.57%～23.36%.第60天时，石灰配施5%腐殖酸处理组(T3)的土壤FDA水解酶活性较CK显著增加，增幅为29.38%，而T1和T2处理组均与CK无显著差异；与CK相比，石灰配施生物质炭处理组的土壤FDA水解酶活性有不同程度的降低，降幅范围为10.50%～13.70%.

图6 不同处理对土壤FDA水解酶活性的影响Fig.6 Effects of different treatments on soil FDA hydrolytic enzyme activity

由图7可见：随培养时间的延长土壤蔗糖酶活性呈显著上升趋势，与CK相比，不同组配改良剂均能不同程度地抑制土壤蔗糖酶活性.第30天时，与CK相比，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)的土壤蔗糖酶活性较CK分别显著降低了45.86%、30.58%和39.46%，而石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的土壤蔗糖酶活性较CK分别显著降低了36.17%、27.60%和49.81%；第60天时，石灰配施腐殖酸处理组对土壤蔗糖酶活性的抑制作用高于石灰配施生物质炭处理组，其中，石灰配施腐殖酸处理组的土壤蔗糖酶活性较CK分别显著降低了40.31%、42.83%和30.84%，石灰配施生物质炭处理组的土壤蔗糖酶活性较CK分别显著降低了16.53%、17.66%和11.10%.

图7 不同处理对土壤蔗糖酶活性的影响Fig.7 Effects of different treatments on soil sucrase activity

由图8可见：随培养时间的延长土壤过氧化氢酶活性无显著变化，与CK相比，不同组配改良剂均能不同程度地增加土壤过氧化氢酶活性，其中石灰配施生物质炭处理组对土壤过氧化氢酶活性的增加效果强于石灰配施腐殖酸处理组.第30天时，与CK相比，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)的土壤过氧化氢酶活性的增幅分别为33.68%、38.62%和27.86%，各处理间差异不显著；石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的增幅分别为70.76%、79.88%和113.56%，T4和T5处理组之间差异不显著.第60天时，石灰配施腐殖酸处理组(T1、T2和T3)的土壤过氧化氢酶活性较CK分别增加了21.15%、37.56%和23.10%；石灰配施生物质炭处理组(T4、T5和T6)的土壤过氧化氢酶活性较CK分别显著增加了80.09%、70.93%和102.79%，T4和T5处理组之间无显著差异.

图8 不同处理对土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.8 Effects of different treatments on soil catalase activity

2.6 土壤微生物活性与土壤有效态Pb、Cd含量的相关关系

由表1可见，土壤基础呼吸强度、土壤微生物代谢熵、土壤过氧化氢酶均与土壤有效态Pb、Cd含量呈极显著负相关(p<0.01)，土壤脲酶活性与土壤有效态Pb、Cd含量均呈显著负相关(p<0.05)，土壤蔗糖酶活性与土壤有效态Pb、Cd含量均呈极显著正相关(p<0.01).

表1 土壤微生物活性与土壤有效态Pb、Cd含量的相关系数Table 1 Correlation coefficients of soil microbial activity with soil available Pb and Cd content

3 讨论

土壤中重金属的存在形态决定着其生物毒性，研究[20]表明，油菜吸收重金属Pb、Cd和砷的量取决于土壤中三者的有效态含量，而不是土壤中Pb、Cd和砷的总量.因此，为减轻重金属污染对人体健康和生态安全造成的威胁，研究降低土壤中有效态重金属含量的技术迫在眉睫.该研究表明，在农田Pb、Cd污染土壤中施加石灰配施腐殖酸和石灰配施生物质炭处理均能显著降低土壤中有效态Pb、Cd含量，其原因可能是石灰的施入可以提高土壤pH，促进Pb、Cd等重金属形成碳酸盐沉淀或氢氧化物沉淀，降低重金属的有效性[21-22].此外，配合施用腐殖酸和生物质炭会增加土壤对重金属离子的吸附能力，因为土壤有机质矿化产物能与土壤胶体表面的活性位点相结合，形成重金属离子交换中心[23].而施用腐殖酸和生物炭则可以快速提升土壤有机质含量[24-25]，降低Pb、Cd在土壤中的移动性，从而减少土壤有效态Pb、Cd含量.该研究还发现，随着配施腐殖酸量的增大，土壤有效态Pb含量逐渐降低，而有效态Cd含量随腐殖酸施加量的增加而增大，因此对于不同重金属的修复，腐殖酸的施用量不尽相同.对于石灰配施生物质炭处理组，土壤有效态Pb、Cd含量均随生物质炭配施量的增加而下降，其主要是因为生物质炭通过物理吸附、沉淀及络合作用等方式降低了土壤中Pb、Cd含量，与杜彩艳等[24]研究结果相似.

土壤微生物是土壤有机组分和生态系统中最活跃的部分，是用于表征土壤质量和土壤肥力的重要生物学指标[26].土壤基础呼吸强度和土壤微生物代谢熵是综合反映土壤污染对土壤微生物活性影响的重要参数[27].该研究发现，在培养期内，施用改良剂的土壤基础呼吸强度和微生物代谢熵较CK均有不同程度的增加，一方面可能是石灰的施入产生较多的氢氧根离子，可与酸性土壤发生中和反应，增加土壤的pH，从而降低了土壤中重金属Pb、Cd的生物有效性，减少了重金属对微生物生长的毒害作用[28]，促进了土壤微生物的生长和繁殖；另一方面腐殖酸和生物质炭施入土壤有利于改善土壤团粒结构及土壤的吸水性和透气性，增加土壤养分含量，从而提高土壤微生物对碳源的利用程度，增强其土壤呼吸强度[29-30].其中，石灰配施生物质炭处理组土壤基础呼吸强度和土壤微生物代谢熵总体上高于石灰配施腐殖酸处理组，可能是因为生物质炭的施入不仅可以改善土壤理化性质，增加土壤的比表面积和孔隙度，还能提高土壤阳离子交换能力和pH，改变土壤中重金属Pb、Cd的赋存形态，从而减小其生态有效性，降低毒害作用[31]，增强土壤微生物的呼吸作用.因此，在重金属污染农田土壤中施加石灰和生物质炭更能有效地提高土壤微生物活性，改善重金属污染土壤的生态功能.

土壤微生物量碳既是土壤有机碳中最活跃的部分，也是土壤中最易变化的部分，其含量大小是反映土壤受污染程度的重要参考依据[32].该研究发现，与CK相比，各改良剂处理组均可不同程度地增加土壤微生物量碳含量(除T1处理组外)，这可能是石灰的施加有利于调节土壤的酸碱度，从而促进土壤微生物的生长，导致微生物量增加.LIU等[33]研究发现，在甘蔗土壤上施加石灰能显著增加土壤微生物碳含量；Fuentes等[34]研究石灰对长期免耕土壤的微生物活性影响时也发现，石灰的施入可以显著增加土壤微生物量碳含量.而腐殖酸和生物质炭中含有大量的不稳定碳，其施入土壤可为微生物生长提供额外的营养物质[35]，增加微生物的生存条件，促进微生物繁殖，进而使土壤微生物量碳含量增加[36].马斌等[37]研究发现，与不施腐殖酸的处理组相比，施加腐殖酸能增加和改善土壤微生物碳，与该研究结果相似.Mierzwa-Hersztek等[38]研究发现，在干旱地区施加生物质炭可显著增加土壤微生物量.因此，在重金属污染土壤中石灰配施腐殖酸和石灰配施生物质炭均能提高土壤微生物量碳含量，均对污染土壤的修复具有积极影响.

土壤酶是土壤微生物活性的敏感指标，对环境物理、化学、生物等因素的变化非常敏感，因此可以通过测定土壤酶活性的大小判别土壤中重金属污染程度[39].土壤脲酶是直接参与土壤中含氮有机物转换的重要水解酶，能催化尿素和有机分子中的碳氢键水解，对促进土壤氮素循环具有重要意义[40].该研究发现，石灰配施中低浓度腐殖酸能增加土壤脲酶活性，配施高浓度5%腐殖酸会降低土壤脲酶活性.而石灰配施不同浓度的生物质炭均能显著增大脲酶活性，这与许云翔等[41]施用生物质炭后稻田土土壤脲酶活性增加的结果相似，可能是生物质炭的施用不仅增加了土壤的肥力，还能促进尿素水解所产生的NH4+的氧化过程，进而加速NH4+的消耗，促进脲酶水解过程的发生[41].

土壤FDA水解酶主要包括蛋白酶、酯酶和脂肪酶等，其活性能反映土壤中微生物总的活性，被认为是土壤健康质量的生物学指标之一[41].该研究发现，石灰配施低中浓度腐殖酸对土壤FDA水解酶活性无显著影响，而配施高浓度(5%)腐殖酸能显著增加土壤FDA水解酶活性，这可能是因为腐殖酸丰富的有机质可以改变土壤孔隙度和通气度及土壤团粒结构，具有显著缓冲作用和持水力，为土壤FDA水解酶发挥作用提供场所和适宜的条件[42].而石灰配施生物质炭时，各处理组的土壤FDA水解酶活性较CK均显著降低，一方面可能是因为石灰的施用降低了土壤有效态重金属浓度，减弱了土壤生态毒性，从而导致水解酶活性降低；另一方面可能是生物质炭的表面是多孔结构，将其施入土壤，会将土壤中的FDA水解酶分子隔离于其微孔之中，对酶促反应结合位点形成保护[43]，从而使生物质炭阻止了酶促反应的进行，进而降低了土壤FDA水解酶活性.

土壤蔗糖酶也称转化酶，也是土壤中重要的一种水解酶类，其能通过水解蔗糖来提供生物所需的能量，对土壤碳循环具有重要意义[44].该研究发现，CK中土壤蔗糖酶活性普遍高于施加组配改良剂处理组，可能是由于土壤蔗糖酶活性在中等污染程度以下的土壤中会表现出激活效应[45]，而石灰与腐殖酸或与生物质炭协同作用能有效去除土壤中的Pb、Cd复合污染物，降低土壤生态毒性，降低了激活作用，从而使得土壤蔗糖酶活性降低.

过氧化氢酶是广泛存在于土壤和生物体内的一种氧化还原酶类，能够促进多种化合物的氧化，并能分解土壤中的过氧化氢，降低其对土壤微生物的毒害作用，为土壤微生物提供更好的生长环境[46].该研究中各组配改良剂处理组的土壤过氧化氢酶活性均表现出显著增大的趋势，这可能是因为石灰与腐殖酸或与生物质炭的施入均显著降低了土壤中重金属有效态含量，降低了有毒物质的积累，促进了微生物的呼吸作用，增加了微生物对土壤中过氧化氢的分解，进而增加过氧化氢酶活性.

4 结论

a) 石灰配施腐殖酸和石灰配施生物质炭均能显著降低土壤中有效态Pb、Cd含量，提高农田重金属污染土壤基础呼吸强度和微生物量碳含量，其中石灰配施生物质炭对土壤Pb、Cd有效态含量的降低及土壤基础呼吸作用的增强效果优于石灰配施腐殖酸.

b) 农田重金属污染土壤中各种酶活性对于石灰配施腐殖酸或石灰配施生物质炭的响应不完全相同.两种组配改良剂处理组总体上对脲酶和过氧化氢酶活性均有促进作用，而均对蔗糖酶活性有一定抑制作用.因此，石灰配施腐殖酸或石灰配施生物质炭均可缓解Pb、Cd污染对土壤微生物活性的胁迫作用，但在Pb、Cd污染土壤中施用石灰组配改良剂对土壤微生物活性的深层影响机理还有待进一步研究.