青海高原地区藏族宫颈癌新辅助化疗敏感性相关miRNA谱研究

青海大学附属医院（810000）沙仁高娃 郭桂兰 阿小英 鲍统惠

宫颈癌是临床常见的女性恶性肿瘤，其发病及死亡率可排在女性恶性肿瘤的前三位[1]。青海地区的宫颈癌发病率与全国平均水平相当，且青海高原藏族人群的宫颈癌检出率要明显高于汉族人群，并呈年轻化的趋势。宫颈癌根治术是目前治疗宫颈癌的最主要的方式，但多数患者术前及术后需靠化疗药物辅助治疗，化疗毒副反应及经济负担对患者带来巨大压力[2][3]。新辅助化疗是一种有效的化学治疗方法，对缩小肿瘤及转移有着积极作用[4]。目前临床上对化疗疗效存在较大分歧，因此对宫颈癌患者化疗药物的敏感性检测，做到个体化的药物治疗势在必行。微小RNA（mirRNA）是一种具有调节作用的非编码RNA，可参与多种肿瘤基因的调控过程，对其发生发展影响较大[5]。在宫颈癌发生发展中是否存在mir表达差异，宫颈癌化疗敏感及抵抗患者miRNA表达谱如何，对其新辅助化疗的疗效有着深远的影响。本研究通对青海地区藏族子宫颈癌组织新辅助化疗前后相关的miRNA表达谱进行检测，并结合临床化疗有效性，确定与化疗敏感性相关的差异表达基因，以期为宫颈癌的治疗提供新的药物作用靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月～2018年2月期间，我院收治宫颈鱗癌患者36例。纳入标准：①符合宫颈鱗癌诊断标准[6]，并经影像学及病理学检查诊；②FIGO分期≤Ⅱa，均给予新辅助化疗；③签署知情同意书；排除标准：①伴有精神类疾病及自身免疫系统疾病者；②哺乳期及妊娠期者。所有患者签署知情同意书。根据治疗情况分为治疗敏感组（20例）和治疗抗拒组（16例），治疗敏感组年龄36～63岁，平均年龄（49.46±7.42）岁；BMI为（22.13±1.35）Kg/m2；FIGO分期：Ⅰb2 12例，Ⅱa 8例。治疗抗拒组年龄38～62岁，平均年龄（49.85±7.63）岁；BMI为（22.17±1.48）Kg/m2；FIGO分期：Ⅰb2 10例，Ⅱa 6例。两组患者一般资料情况差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 新辅助化疗 所有患者均给予TP方案（力朴素+卡铂），通过静脉滴注化疗：静脉滴注力朴素（生产厂家：南京绿叶思科药业有限公司，批准文号：国药准字H20030357）剂量：135mg/m2，卡铂（生产厂家：齐鲁制药有限公司，批准文号：国药准字H20020180）静脉滴注，按血药浓度-时间曲线下面积（AUC）和肌酐清除率来计算卡铂的剂量：卡铂剂量（mg）=所设定的AUC（mg/ml/min）×［肌酐清除率（ml/min）+25］。其中：AUC（mg/ml/min）取值为5；内生肌酐清除率（Ccr）=(140-年龄)×体重(kg)/72×Scr(mg/dl)×0.85，给药前30分钟，给予患者静脉推注地塞米松（生产厂家：广西万德药业股份有限公司，批准文号：国药准字H20113234）10mg，肌肉注射苯海拉明（生产厂家：天津金耀药业有限公司，批准文号：国药准字H12020617）20mg，静脉加壶西咪替丁（生产厂家：广东南国药业有限公司，批准文号：国药准字H44024630）40mg。

1.2.2 相关miRNA谱检测

1.2.2.1 相关仪器及试剂 实验主要仪器为：电泳仪（型号：Bio-RaD，厂家：美国Bio-Rad公司）、倒置显微镜（型号：Olympus IX71，厂家：日本OLYMPUS）、全自动显微照相系统（日本Olympus）。主要试剂：裂解液（德国Qiagen公司）、TRNzol总RNA 提取试剂（天根生化科技（北京）有限公司）、反转录试剂盒（日本Takara公司）、Taqman microRNA 探针（美国Applied Biosystems公司）。

1.2.2.2 样本采集及miR-138、miR-720及miR-96检测 采集各组患者的宫颈癌病理组织标本，采用qRT-PCR技术检测宫颈癌组织中miR-138、miR-720及miR-96的表达：①将标本组织研磨至粉状；②按照Trizol试剂的说明书提取组织总RNA（纯度比值范围控制：1.8～2.0）；③标记microRNA，并进行miRNA芯片杂交，并扫描及数据分析；④选取miRNA芯片结果中的miR-138、miR-720及miR-96进行荧光定PCR分析：采用反转录试剂盒配置反应混合物，反转录合成环状DNA；RT-PCR反应条件：95℃变性10s，60℃退火20s，70℃延伸10s，40个循环，相关引物序列由上海生工公司提供，每次循环均设空白对照，计算目的基因 mRNA的相对表达量，每组重复3次取均值。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分析并鉴定。基因相对表达量：△Ct（目标基因）=目标基因Ct-对照基因Ct，△△Ct=△Ct（目标基因）-△Ct（标准值），目标基因的相对表达量则为2-△△Ct。

1.3 观察指标

1.3.1 化疗前后对患者进行三维超声检查，均由同一名资深影像医生进行测量，观察肿瘤体积变化情况，肿瘤体积=肿瘤最大垂直径线及水平径线的乘积。

1.3.2 分组方法 化疗抗拒组：治疗结束12个月时，肿瘤未消退或增大，或发现新肿瘤病灶，影像学及病理检查发现肿瘤证据。化疗敏感组：治疗结束12个月时，肿瘤完全消退，未新发肿瘤病灶，血清鳞状上皮细胞癌抗原水平降至正常范围内，且治疗结束后12个月内影像学及病理检查未发现肿瘤证据。

1.4 统计学处理 本次研究使用SPSS19.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）统计学软件处理数据，其中计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用X2检验；相关性采用Spearman分析，当P＜0.05时表明数据差异具有统计学意义。

2 结果

附表1 两组miR-138、miR-720及miR-96表达情况

附表2 miR-138、miR-720及miR-96与肿瘤体积变化相关性

2.1 两组血清miR-138、miR-720及miR-96表达情况 与化疗前相比，治疗敏感组化疗后miR-138和miR-720表达均上调，miR-96表达明显下调（P＜0.05）；治疗抗拒组化疗前后miR-96、miR-138及miR-720表达无明显差异（P＞0.05），见附表1。

2.2 miR-138、miR-720及miR-96表达变化与肿瘤体积变化的相关性 Spearman 相关性分析结果显示，化疗前后miR-96表达变化与肿瘤体积变化呈正相关，miR-138及miR-720表达变化与肿瘤体积变化呈负相关（P＜0.05），见附表2。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，中老年女性是高发群体，近些年呈年轻化趋势[7]。宫颈癌可分为腺癌和鳞癌两类，后者最常见，可占宫颈癌的3/4左右。据相关统计数据显示，全球每年约48万女性患宫颈癌，其5年生存率约为70%左右，给女性健康带来严重影响，目前已成为一个公共卫生问题。我国属于宫颈癌高发区，位居世界第二[8]。宫颈癌的患病因素较多，可包括分娩次数、其他妇科疾病、病毒感染、生物学因素、性行为及遗传因素等，早期临床症状不显著，易被漏误诊。目前给宫颈癌患者创造手术机会，并提高疗效已成为临床研究的热点。

新辅助化疗是最早被应用于治疗乳腺癌的一种重要治疗手段，后来被应用于宫颈癌的治疗，对宫颈癌的术前治疗起到积极作用[9]。本研究治疗方案中的力朴素，其主要成分为紫杉醇，其属于一种天然抗癌药物，对宫颈癌有特效[10]。治疗方案中的卡铂，无需水化且易于溶解，毒副反应相对较小，对宫颈肿瘤的生长有着抑制作用[11]。本研究中尽管对患者均采用新辅助化疗方案，但其疗效却存在较大的差异，部分患者出现明显的化疗抗拒。因此寻找预测化疗敏感性的方法显得十分迫切。

近些年，对化疗敏感性的机制及有关预测因素成为的医学研究的热点，miRNA、COX-2及ERCC1等在分子生物学领域内被热门关注[12]。miRNA是一种调节基因表达关键的内源性因子，在机体免疫系统中起重要作用，不仅可反映组织及细胞的生理状态，还会参与自身免疫疾病的发生发展过程，在癌变病理过程中起到重要作用[13]。miRNA可阻止RNA酶降解，且一条miRNA可调控多种miRNA表达，并具有相对的稳定性，因此有限条件下可对全基因进行分析。miRNA可在血液中被提纯而检测到，避免入侵性检查，使检测变的更简单快捷，且重复性高[14]。相关研究证明，不同的恶性肿瘤具有各自较特异的miRNA表达谱，其作为肿瘤标记物的优越性明显，对肿瘤的辅助诊断价值较高[15]。

本研究结果显示，治疗敏感组化疗后miR-138和miR-720表达均上调，miR-96表达明显下调，而治疗抗拒组化疗前后miR-96、miR-138及miR-720表达无明显差异，这可能是因为高表达的miR-138可对同源染色体进行抑制，从而增加化疗药物对细胞DNA损伤的敏感性，从而增强肿瘤细胞易感性，从而对肿瘤进展和扩散的抑制效果增强[16]。低表达的miR-720和miR-138会促进淋巴结转移和脉管浸润，这可能是宫颈癌患者耐药的重要原因，而高表达的miR-720可通过负性调控其靶蛋白发挥其改变DNA损伤修复能力的生物学效应，抑制上皮-间质转化，从而使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性増强[17]。高表达的miR-96会导致肿瘤的发生发展，下调的miR-96会降低癌细胞的侵袭和迁移力，增强新辅助化疗方案中的紫杉醇诱导肿瘤细胞调亡的效果，并减缓肿瘤生长[18]。miR-96表达变化与肿瘤体积变化呈正相关，miR-138及miR-720表达变化与肿瘤体积变化呈负相关，说明了下调的miR-96，及上调的miR-138及miR-720会缩减肿瘤的体积，缩小淋巴结转移范围及间质浸润深度，从而使宫颈癌患者获得较好的手术机会。

综上所述，青海地区藏族宫颈癌在发生发展中miRNA存在差异表达，miR-96、miR-138及miR-720与宫颈癌化疗敏感性相关，可为患者疗效及预后提供指导，并为其个性化治疗提供新的思路。