重组人骨形成蛋白-4对人成骨样细胞MG-63增殖分化的影响

胡 骏，张俊溢，刘雯君，黄文霞

(1.厦门大学附属中山医院口腔科，福建 厦门 361000；2.厦门市第五医院口腔科，福建 厦门 361000；3.厦门医学院附属口腔医院种植2科，福建 厦门 361000；4.厦门医学院附属口腔医院牙周科，福建 厦门 361000)

正畸矫治过程中，温和而持续的矫治力作用于牙体，使牙槽骨改建，引起牙齿移动。牙齿移动正是在成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收这样一个成骨—破骨的动态平衡中进行[1]。牙周膜细胞、成骨细胞以及破骨细胞等多种细胞参与牙槽骨的动态平衡改建[2]。成骨细胞是骨形成和骨改建中重要的功能细胞，成骨细胞增殖及分化能力直接影响到牙槽骨的改建过程。在机械压力的刺激作用下，成骨细胞内多种信号转导通路被激活，参与调节牙槽骨代谢与改建[2]。骨形成蛋白-4属于骨形成蛋白家族和TGF-β家族，通过调控成骨细胞生长增殖、分化、迁移及凋亡能力，对软骨及骨的形成与修复具有重要的诱导作用[3]。本文探讨重组人骨形成蛋白-4(recombinant human bone morphogenetic protein-4，rhBMP-4)对体外培养的人成骨样细胞MG-63 的增殖和分化活性的影响，为临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；MTT(上海碧云天生物技术有限公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒、羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；二甲基亚砜(美国Merck 公司)、Triton X-100(美国Sigma 公司)；ELx800UV 酶联免疫检测仪(美国BioTek公司)。

1.2 细胞株及其培养

人成骨样细胞系MG-63 由中国典型培养物保藏中心提供，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，培养在体积分数为5%的CO2、37 ℃培养箱中，平均2 d更换1次培养液，每隔3～4 d进行1次细胞传代。

1.3 MTT比色法测定细胞增殖率

用胰酶消化法将对数生长期MG-63 细胞制成6×104个/mL 细胞浓度的细胞悬液，每孔100 μL细胞悬液均匀接种于96孔培养板，5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后，更换含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液同步化24 h后，低、中、高rhBMP-4 组分别加入终浓度为5、10、20 ng/L 的 rhBMP-4，空白对照组只加DMEM 培养液、阴性对照组加MG-63 细胞和DMEM 培养液，每组设5 个复孔，分别作用8、20、32、44 h 后取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)清洗1次，再在每孔中加入0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.3)100 μL 和 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，继续培养4 h 后，吸出培养液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，摇匀，用酶标仪分别测定其540 nm波长处的光密度(D)。实验重复3 次，取平均值计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率=[(D实验组-D空白对照组)/(D阴性对照组-D空白对照组)]×100%[4]。

1.4 PNP比色法测定细胞碱性磷酸酶活性

经10 ng/mL rhBMP-4 培养36 h 后出现肉眼可见的贴壁细胞时，将上清液移至EP管，以备后续实验用，用PBS 缓冲液小心浸洗3 次，每孔加入100 μL 0.2%Triton X-100，于4 ℃下作用12 h，使细胞完全裂解，制成细胞裂解液。取30 μL 裂解液接种于另一96 孔培养板，空白对照孔用PBS 缓冲液取代rhBMP-4 细胞裂解液调零。按碱性磷酸酶测定试剂盒说明书加入同等比例缓冲液和基质液，5%CO2、37 ℃培养箱中培养30 min，加显色剂，使用酶标仪检测D(405)值。实验结果与对照比较，实验重复3次，取平均值。

1.5 羟脯氨酸测定试剂盒检测细胞羟脯氨酸含量

经10 ng/mL rhBMP-4 培养36 h 后出现肉眼可见的贴壁细胞时，取50 μL 上清液移至EP 管，按羟脯氨酸测定试剂盒说明书逐步加入各试剂，使用酶标仪检测D(570)值。实验结果与对照比较，实验重复3次，计算平均值。

1.6 统计学分析

应用SPSS11.5 统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rhBMP-4对MG-63细胞增殖影响

与对照组比较，5、10、20 ng/mL 的rhBMP-4均能诱导MG-63 细胞的增殖(P<0.05)，且呈浓度依赖性(图1A)；10 ng/mL rhBMP-4 组与 20 ng/mL rhBMP-4 组间对MG-63 细胞增殖影响的差异无统计学意义(P>0.05)。在后续实验中以10 ng/mL rhBMP-4 进行研究。进一步研究发现10 ng/mL rhBMP-4作用24 h后即可促进MG-63细胞增殖(P<0.05)，随着时间的延长，其促增殖作用更加显著，呈明显的时间依赖性(图1B)。

2.2 rhBMP-4 对MG-63 细胞碱性磷酸酶活性的影响

如图2 所示，与对照组比较，10 ng/mL rhBMP-4增强了MG-63细胞的碱性磷酸酶活性(P<0.05)。

2.3 rhBMP-4 对MG-63 细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响

如图3 所示，与对照组比较，10 ng/mL rhBMP-4可刺激MG-63细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白(P<0.05)。

图1 rhBMP-4对MG-63细胞增殖影响

图2 rhBMP-4对MG-63细胞碱性磷酸酶活性影响

图3 rhBMP-4对MG-63细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响

3 讨论

MTT 法是一种通过颜色反应来检测细胞生长增殖和存活的方法[5]。其原理是活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将MTT 还原为难溶性的蓝紫结晶物甲臜，而甲臜生成量与细胞的增殖程度呈正相关，用酶标仪检测D(540)，能间接反映活细胞的数量及活性。本研究用MTT 法检测人成骨样细胞的增殖能力，根据测定结果来看，10 ng/mL rhBMP-4能促进人成骨样细胞MG-63的增殖。

碱性磷酸酶是成骨细胞的一种标志性外酶，从成骨组织中释放出来而进入骨样组织后发生钙化[6]，是早期成骨的标志，它与牙周组织的改建密切相关。碱性磷酸酶活性越高，骨形成能力越强，骨基质矿化越快，碱性磷酸酶的定量检测可作为成骨细胞分化程度和功能状态的评价指标。本研究发现，10 ng/mL rhBMP-4 能增强人成骨样细胞MG-63的活性。

成骨细胞可分泌基质蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白是其成骨阶段分泌的主要矿化相关蛋白，是反映成骨的重要特异性指标[7]。羟脯氨酸是Ⅰ型胶原蛋白合成所必需的前体氨基酸，可作为衡量机体胶原含量的重要指标。rhBMP-4 是否影响人成骨样细胞MG-63分泌Ⅰ型胶原可通过检测培养液中羟脯氨酸的含量来验证。本研究培养液中加入10 ng/mL rhBMP-4 后，羟脯氨酸的含量明显提高，表明rhBMP-4 能促进成骨细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白，从而增进骨的形成与矿化。

综上所述，本研究证实BMP-4 可诱导人成骨样细胞MG-63的增殖与分化，为BMP-4诱导成骨细胞活性的临床应用提供依据。