阈下剂量钙拮抗剂的血药峰浓度测定

林 盛，江泽斌，郑付春，石刚刚

(1.汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院第一附属医院临床药理实验室，广东 汕头 515041)

急性心肌梗死是目前死亡率较高的一种疾病，临床上常用经皮冠状动脉介入治疗手术开通狭窄血管。缺血心肌组织恢复血流后，损伤却进一步加重，该现象称为心肌缺血再灌注损伤[1]。本课题组前期研究观察到C57 小鼠腹腔注射维拉帕米(verapamil，Ver)1.0 mg/kg、硝苯地平(nifedipine，Nif)0.3 mg/kg、地尔硫䓬(diltiazem，Dil)0.5 mg/kg和碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F2)1.0 mg/kg，可以改善小鼠缺血再灌注后的心功能以及减少心肌酶的漏出[2]，该用药剂量不引起钙通道阻断所致的血液动力学变化，我们称之为“阈下剂量”。临床研究方案中，以小鼠腹腔注射Ver“阈下剂量”为1.0 mg/kg 折算，患者口服Ver剂量是0.3 mg/kg，大多数患者体重在60～70 kg 之间，因此拟定口服Ver 20 mg 为“阈下剂量”。本研究测定患者口服Ver 20 mg 后的血药峰浓度，以是否低于阻断钙通道所致血液动力学变化的最小有效浓度为标准，判断其是否为阈下浓度；测定小鼠经腹腔注射“阈下剂量”的Ver、Nif、Dil和F2的血药峰浓度是否低于最小有效剂量的血药浓度，判断其是否为“阈下剂量”。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

Ver 对照品(HPLC 级，纯度≥99.0%，美国Sigma 公 司 ， 批 号 MKBV4993V)； Ver 注 射 液(上海禾丰制药有限公司，批号43180401)；Nif 对照品(HPLC级，纯度≥98.0%，美国Sigma公司，批号 MKCB9232)； Dil 对照 品(HPLC 级 ， 纯 度≥99.0%，美国Sigma 公司，批号MKBW4898V)；F2对照品(HPLC 级，纯度≥99.0%，批号20170309)；内标巴马汀(palmatine，Pal)对照品(HPLC级，纯度≥98.0%，大连美仑生物技术有限公司，批号B0613AS)。API 6500 型三重四极杆质谱仪(美国ABSCIEX 公司)；LC-30A 高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

1.2 实验对象

临床急性心肌梗死患者80例来源于汕头市潮南民生医院，本研究经汕头市潮南民生医院伦理委员会审核批准，患者均签署知情同意书。C57BL/6JNifdc 小鼠，SPF 级，雄性，25～30 g，购自北京维通利华公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0006。

1.3 给药方案及血样采集

急性心肌梗死患者随机分组，经皮冠状动脉介入治疗手术前口服给药：(1)实验组50例，口服含20 mg Ver 注射液的温水20 mL；(2)安慰剂组30例，口服温水20 mL。给药1.5 h(达峰时间1～3 h)后经肘部静脉采血1 mL，置于一次性静脉血样采集容器(EDTA-K2)，4 ℃，3 000 r/min 离心 10 min，-80 ℃冷冻贮存。

小鼠随机分组，每组6 只，腹腔注射给药。给药方案及分组情况如下。(1)阈下剂量：Ver 1.0 mg/kg 组 ，Nif 0.3 mg/kg 组 ，Dil 0.5 mg/kg 组 ， F21.0 mg/kg 组；(2)最小有效剂量：Ver 1.5 mg/kg组，Nif 0.4 mg/kg 组，Dil 0.75 mg/kg 组，F21.5 mg/kg 组。Nif 组于给药 5、10、15、20 min 后经眼眶后静脉丛采血，其他药物组于给药2、5、10、15 min后经眼眶后静脉丛采血。每个时间点采血210 μL，置于经EDTA 处理的1.5 mL 离心管中，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，-80 ℃冷冻贮存。

1.4 血药浓度测定

1.4.1 色谱和质谱条件色谱柱为XB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，保护柱为 XB-C18(5 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流动相为乙腈—水溶液(V乙腈∶V水=35∶65，含 2 mmol/L 甲胺与 6 mmol/L 甲酸)，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量3 μL，运行时间11 min，内标为Pal。质谱采用电喷雾离子源，多反应正离子监测(MRM)扫描模式。源电压：5 300 V；源温度：450 ℃；气帘气：35 psi(1 psi≈6.9 kPa)；碰撞气：8 psi；雾化气：45 psi；辅助气：40 psi；Ver、Nif、Dil、F2、Pal 的监测离子对分别为：m/z455.3→165.2，m/z378.2→315.1，m/z415.0→178.1，m/z432.2→165.1，m/z352.2→336.2。

1.4.2 标准曲线和质控样品的配制精密称取各对照品，甲醇溶解并定容，分别配制成200 μg/mL的储备液，置于-80 ℃冷冻贮存。取适量各分析物储备液，以甲醇为溶剂配制含3.2 μg/mL Ver、1.6 μg/mL Nif、2.4 μg/mL Dil、2.4 μg/mL F2的混合工作液，逐级稀释，与空白血浆配制含有2～400 ng/mL Ver、 1～200 ng/mL Nif、 1.5～300 ng/mL Dil、1.5～300 ng/mL F2的标准曲线样品。配制含有6、160、 320 ng/mL Ver， 3、 80、 160 ng/mL Nif，4.5、120、240 ng/mL Dil，4.5、120、240 ng/mL F2的低浓度(QCL)、中浓度(QCM)、高浓度(QCH)质控样品。内标Pal储备液以甲醇为溶剂稀释2次，配制成1 μg/mL的工作液。

1.4.3 血浆样品处理取血浆样品100 μL 至1.5 mL离心管中，加入1 μg/mL的内标Pal 20 μL和乙腈300 μL，涡旋振荡30 s，-10 ℃，12 000 r/min离心 10 min，取上清液 150 μL 经 0.22 μm 滤膜过滤至进样瓶。

1.5 方法学考察

1.5.1 选择性通过比较6 批来自不同供体的空白血浆、标准曲线定量下限(LOQ)血浆样品(添加了分析物和内标)和真实血浆样品的色谱图，当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%，并低于内标响应的5%时，即可以接受。

1.5.2 线性和范围用9 个不同的校正浓度水平对方法的线性进行评价，连续评价6 条标准曲线。以分析物与内标峰面积比值对分析物浓度进行最小二乘法回归运算，加权系数1/x2，得到相应的方程。

1.5.3 准确度与精密度按1.4.2 配制4 个不同浓度水平(LOQ、QCL、QCM和QCH)的样品，每批每个浓度水平6 份，连续6 批，按1.4.3 处理，进样分析，对批内准确度、批间准确度、批内精密度、批间精密度进行统计，质控误差应在±15%范围内(定量下限在±20%范围内)。

1.5.4 回收率与基质效应按1.4.2 配制质控样品，每个浓度水平6 份，按1.4.3 处理后进样分析，各对照品峰面积与等浓度水平的甲醇溶液峰面积之比，即为样品的回收率，要求相对标准偏差在±15%范围内。使用6 批来自不同供体的空白血浆，从6 批基质计算的内标归一化的基质因子的相对标准偏差应该在±15%范围内，在2 个浓度水平(QCL和QCH)进行。

1.5.5 代替基质的验证按1.4.2 配制人血浆的标准曲线样品、人血浆的质控样品3 份、小鼠血浆的质控样品及定量下限样品各6份，连续6批，按1.4.3 处理后进样分析，对批内、批间准确度与精密度进行统计，质控误差在±15%范围内(定量下限在±20%范围内)，符合方法学考察的标准，不影响分析物的定量。

1.5.6 稳定性按1.4.2 配制质控样品，每个浓度水平3 份，共4 批，分别评估在室温放置4 h、在进样器(10 ℃)放置20 h、反复冻融3 次与-80 ℃冷冻贮存3个月的稳定性，偏差应在±15%范围内。

2 结果

2.1 质谱结果

将5 种对照品溶液分别注入质谱仪，电喷雾正离子模式能产生良好的质谱响应，Ver、Nif、Dil、F2、Pal 丰度最高的碎片离子分别是m/z165.2、m/z315.1、m/z178.1、m/z165.1、m/z336.2。见图1。

图1 对照品溶液质谱图

2.2 方法考察

2.2.1 选择性在人和小鼠血浆中，Ver保留时间分别为2.81 min 与2.76 min，Nif 保留时间分别为9.43 min 与9.45 min，Dil 保留时间分别为1.79 min与1.77 min，F2保留时间分别为6.77 min 与6.72 min，内标Pal 保留时间分别为1.51 min 与1.53 min，均未观察到来自内源性物质的干扰(图2、图3)，说明本方法具有良好的选择性，且每种分析物在人和小鼠血浆的保留时间接近。

2.2.2 线性分析物的回归方程相关系数r均大于0.999，线性关系良好。

2.2.3 准确度与精密度人血浆质控样品相对偏差与相对标准偏差在±15%范围内，人血浆定量下限样品相对偏差与相对标准偏差在±20%范围内，符合中国药典2015年版《生物样品定量分析方法验证指导原则》[3]对准确度和精密度的要求。

2.2.4 回收率与基质效应人、小鼠血浆质控样品回收率的相对标准偏差在±15%范围内，基质效应相对标准偏差在±15%范围内，符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》[3]对基质效应的要求(回收率未作要求)。

图2 急性心肌梗死患者血浆LC-MS/MS色谱图

2.2.5 代替基质的验证小鼠血浆质控样品的相对偏差与相对标准偏差在±15%范围内(定量下限样品在±20%范围内)，符合方法学考察的标准[3]，不影响分析物的定量，见表1，后续实验可以使用人血浆代替小鼠血浆配制标准曲线。

2.2.6 稳定性由新鲜配制的标准曲线分析稳定性实验的质控样品，结果表明，质控样品的偏差均在±15%范围内，说明在室温放置4 h、进样器10 ℃放置20 h、反复冻融3 次与-80 ℃冷冻贮存3个月的稳定性良好，符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》对稳定性的要求[3]。

2.3 方法学应用

2.3.1 患者Ver“阈下剂量”血药峰浓度测定本方法成功应用于临床急性心肌梗死患者的Ver 血药峰浓度测定，经皮冠状动脉介入治疗术前口服单剂量Ver注射液20 mg，在服药后1.5 h经肘部静脉采血1 mL，含药血浆按1.4.3处理进样。50例患者血样中49 例的Ver 血药峰浓度低于产生钙通道阻断作用的最小有效浓度20 ng/mL[4]，基本符合预期。见图4。

2.3.2 小鼠钙拮抗剂“阈下剂量”血药峰浓度的测定本方法亦应用于小鼠血浆中Ver、Nif、Dil和F2浓度的测定，“阈下剂量”钙拮抗剂Ver、Nif、Dil、F2的血药峰浓度分别是 62.62、85.28、44.52、99.87 ng/mL，均低于其最小有效剂量的血药浓度84.58、97.45、45.55、133.00 ng/mL。见图5。

图4 急性心肌梗死患者的Ver血药峰浓度

表1 分析物在小鼠血浆中批内、批间的准确度与精密度(n=6)

图5 小鼠钙拮抗剂“阈下剂量”与最小有效剂量血药浓度

3 讨论

钙拮抗剂血药浓度的测定方法已有报道[5-8]，但Nif的灵敏度不满足本研究的需求。通过添加甲胺[9-11]，提高了Nif 的质谱响应，定量下限1 ng/mL满足研究需求。根据《生物样品定量分析方法验证指导原则》[3]，配制标准曲线及质控样品的基质应该与目标实验样品基质相同，改变其他基质或物种需要部分方法验证。代替基质的研究已有报道[12-13]，本研究通过观察选择性、回收率、基质效应、准确度与精密度，确证了人血浆可代替小鼠血浆配制标准曲线样品，减少小鼠的实验数量。

本课题组前期研究结果表明，最小有效剂量的Ver、Nif、Dil 和F2引起小鼠血流动力学变化的时间远远滞后于达峰时间，所以最小有效浓度难以确定[2]。本研究测得以上4种钙拮抗剂“阈下剂量”的血药峰浓度低于最小有效剂量的血药浓度，结合前期研究“阈下剂量”未引起钙通道阻断所致的血液动力学变化，基本确定腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg 和 F21.0 mg/kg 是不引起钙通道阻断所致血液动力学变化的阈下剂量。

另一方面，本研究发现临床急性心肌梗死患者Ver 血药峰浓度低于临床最小有效浓度，确定了急性心肌梗死患者口服Ver 注射液20 mg 是Ver的阈下剂量。根据临床术前环境，本研究选择口服注射液的给药方式，考虑到剂型的差异是否影响Ver 血药浓度，也测定了口服Ver 注射液20 mg与片剂20 mg的血药峰浓度，结果表明，两种剂型的血药峰浓度差异没有统计学意义(P=0.29)。

综上所述，本研究证实了急性心肌梗死患者口服Ver注射液20 mg的剂量是阈下剂量，小鼠腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg和F21.0 mg/kg 的剂量也基本确定为阈下剂量，为应用钙拮抗剂治疗心肌缺血再灌注损伤采用的“阈下剂量”提供了佐证。