瞬时受体电位通道蛋白5在糖脂代谢中的作用研究

高 俐，祁艳艳，崔艺璇，刘 宽，蔡正达，李干鹏，杨 淬

(1. 云南民族大学民族医药学院，民族药资源化学国家民委教育部重点实验室，云南 昆明 650500；2. 云南省科学技术院，云南 昆明 650228)

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，其机理研究表明糖脂代谢紊乱不仅是糖尿病发生发展的主要因素，也是导致糖尿病患者血管病变的主要原因[1-3]。相关研究表明糖脂代谢过程在糖尿病等代谢综合征的病理生理过程中扮演重要的角色，找到糖脂代谢过程的相关靶点并对其糖脂代谢进行调节，是突破糖尿病以至代谢综合征治疗的重要方向。

瞬时受体电位(TRP)通道是一个大家族，分为TRPC、TRPV和TRPM通道亚型，在体内分布广泛，参与调节血液循环、肠蠕动、矿物质吸收、体液平衡、气道和膀胱的超敏性以及细胞的生长发育等，TRPC离子通道是位于细胞膜上的一类非选择性阳离子通道，主要介导磷脂酶依赖钙离子的内流[4-7]。有研究表明[8]，TRPC4通道为去极化和钙流入胰岛素分泌细胞的途径之一，而TRPC5与糖尿病肾病有重要关系，抑制TRPC5基因可以缓解糖尿病肾病症状[9]。TRPC4与TRPC5具有高度同源性[10]，二者均与糖尿病的发生发展有联系，但其详细的病理生理机制并未明确。TRPC5主要在外周表达，目前对其在体内调节作用知之甚少。本研究使用TRPC5基因敲除小鼠，在正常与高糖环境下分别检测小鼠体内与糖脂代谢过程相关的生化指标，旨在探讨TRPC5对糖脂代谢的影响，从而进一步阐明TRPC5在糖尿病病理过程中的作用机制，为糖尿病治疗提供思路，同时为相关药物的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄的 C57BL/6J小鼠10只，♂，体质量(18±2) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004；6 周龄 TRPC5-/-(TRPC5基因敲除)小鼠，种鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(京)2014-0004，本实验室进行繁殖，通过基因分型筛选出纯合子用于实验。小鼠均饲养于清洁级动物房内，保持光照/黑暗各12 h，恒定循环。环境温度25 ℃，湿度0.40～0.60。

1.2 药物与试剂己糖激酶(HK)测试盒(批号：A077-1)、果糖磷酸激酶(PFK)活性测定试剂盒(批号：A129-1-1)、丙酮酸激酶(PK)测试盒(批号：A076-1)、丙酮酸(PA)测试盒(批号：A081)、总胆固醇(TC)测试盒(批号：A111-1-1)、甘油三酯(TG)测试盒(批号：A110-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒(批号：A113-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒(批号：A112-1)、柠檬酸合成酶(CS)测试盒(批号：A108)、小鼠乙酰辅酶A羧化酶(ACC)酶联免疫检测试剂盒(批号：H232)、小鼠脂肪酸合成酶(FAS)酶联免疫检测试剂盒(批号：H231)、游离脂肪酸(NEFA)测试盒(批号：A042)、糖原测试盒(批号：A043-1-1)，以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；小鼠insulin ELISA试剂盒(批号:Cat No.EM017)购自依科赛生物科技(太仓)有限公司。

1.3 仪器高速离心机(5417R, Eppendorf)，酶标仪(MultiskanGo，Thermo)，微量加样器(Eppendorf)，HW-1000 超级恒温水浴(成都泰盟科技有限公司)。

1.4 实验分组C57BL/6J小鼠与TRPC5-/-小鼠各10只，均随机分为对照组(n=5)和高糖组(n=5)，对照组给予正常饮水，高糖组给予质量浓度为100 g·L-1的糖水各8周。

1.5 小鼠体重及空腹血糖测定称重，剪尾，从尾静脉采集空腹全血，检测空腹血糖(FBG)。此后，连续8周，每周固定时间进行称重，同时检测空腹血糖。

1.6 生化指标检测小鼠喂养8周，最后一次检测体重及空腹血糖后，眼球摘除取血，分离血清，并检测血清中Insulin、HK、PFK、PK、PA、TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量；同时取小鼠肝脏组织，称重，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于检测肝脏中上述生化指标以及CS、ACC、FAS、NEFA、肝糖原含量。同时取小鼠皮下脂肪组织，用于检测FAS和NEFA含量。

1.7 RNA-sequence

1.7.1样品收集与测序 8周后，取小鼠肝脏组织，提取RNA，并检测其纯度及完整性。达到建库要求后进行文库构建，稀释文库至105 mg·L-1，并使用 Agilent 2100 bioanalyzer对文库的 insert size 进行检测。insert size 达到预期后，通过Q-PCR 对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于 2 nmol·L-1)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling，而后进行 Illumina 测序，得到待测片段序列(该过程委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行)。

1.7.2数据分析 将转录组测序数据进行数据质控，序列比对到参考基因。对基因表达水平定量，数据整理后使用R语言软件中edge R 包进行差异基因分析，以校正后的P值<0.01以及 |log2foldchange|>2作为显著差异表达的阈值进行过滤，筛选得到各组间的差异基因。然后利用clusterProfiler进行GO功能分析，注释其参与的生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，使用Omicshare进行KEGG信号通路富集，然后使用Cytoscape中的CytoHubba进行差异基因核心分析。

2 结果

2.1 小鼠体重与空腹血糖各组小鼠体重随着时间增加逐渐增重，且TRPC5-/-组小鼠的体重一直高于C57BL/6J小鼠，且两组间体重差异具有显著性(P<0.05)； TRPC5-/-小鼠空腹血糖一直低于C57BL/6J小鼠，两组间血糖差异具有显著性(P<0.05)，提示TRPC5基因与体重、血糖的变化相关。

高糖组在给予糖水1周后，两组体重无明显差异；2周后，C57BL/6J小鼠组体重高于TRPC5-/-小鼠组(P<0.05)；且给予糖水1月后，TRPC5-/-小鼠与C57BL/6J小鼠的空腹血糖差异无显著性，见Fig 1,实验结果提示TRPC5基因影响糖代谢过程。

Fig 1 Changes of weight and fasting blood sucrose in *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.2 生化指标测定结果

2.2.1小鼠血清中胰岛素含量 各组小鼠饲养8周后，分别取血清，测定血清中胰岛素含量。结果显示对照组C57BL/6J小鼠血清中胰岛素含量高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；而给予糖水8周之后，C57BL/6J小鼠血清中胰岛素含量低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)。这提示正常情况下，敲除TRPC5基因，胰岛素分泌减少；但在高糖刺激下，敲除TRPC5基因反而促进胰岛素分泌。见Fig 2。

Fig 2 Insulin content in serum of *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.2.2小鼠血清中糖脂相关指标 检测结果显示，各组血清中，C57BL/6J小鼠PK和HDL-C含量均高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；而PA、TG、TC含量均低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；两种小鼠间PFK、HK和LDL-C含量差异无显著性(P>0.05)。见Fig 3。提示TRPC5基因影响糖代谢过程及血脂水平。

Fig 3 Determination results of (A) HK, PK, PA, FPK; (B) TC,TG, HDL-C, LDL-Cin mouse serum *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

给予高糖刺激后，两种小鼠的PK、PA、TG以及LDL-C含量均有所下降，且两种小鼠间以上各指标含量趋于差异无显著性(P>0.05)；此外，两种小鼠在高糖刺激下，TC含量均明显升高，且C57BL/6J小鼠升高快于TRPC5-/-小鼠，直至8周后C57BL/6J小鼠TC含量明显高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；值得注意的是，TRPC5-/-小鼠的PFK含量增高，且明显高于C57BL/6J组(P<0.05)，提示TRPC5基因能抑制糖酵解；两种小鼠在高糖刺激下HK含量无明显变化(P>0.05)，见Fig 3。以上结果提示，给予高糖刺激后，一部分糖进入糖酵解过程，一部分糖转化为了脂类中的胆固醇，该过程中TRPC5基因可以在一定程度上抑制糖酵解，促进胆固醇的合成。

2.2.3小鼠肝脏中糖脂相关指标 对照组中，C57BL/6J小鼠的脏器指数高于TRPC5-/-小鼠，其肝脏中PK、PA、NEFA含量均低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；二者间TC、LDL-C和HDL-C含量差异无显著性(P>0.05)；C57BL/6J小鼠TG与肝糖原含量高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)。

高糖刺激后，二者HDL-C和肝糖原含量增高，且C57BL/6J小鼠明显高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05,P<0.01)；但TRPC5-/-小鼠ACC含量明显高于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。见Fig 4。

Fig 4 Determination results of (A) liver wet / weight(B) HK, PK, PFK, CS; (C) TC, TG,HDL-C, LDL-C；(D) PA, NEFA; (E) ACC, FAS; (F) Glycogen in *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05,##P<0.01 vs C57BL/6J(Sucrose).

2.2.4小鼠皮下脂肪中相关指标 结果显示，对照组TRPC5-/-小鼠FAS与NEFA含量均高于C57BL/6J小鼠(P<0.05),见Fig 5。

高糖刺激后，两组小鼠的FAS含量有所增高，但C57BL/6J小鼠组增高大于TRPC5-/-小鼠，直至8周后两组小鼠间FAS含量差异无显著性(P>0.05)；同时，C57BL/6J小鼠NEFA含量有所上升，8周后两组小鼠之间差异无显著性(P>0.05),见Fig 5，提示高糖刺激下TRPC5基因促进该部位脂肪酸合成，进而促进皮下脂肪合成。

2.3 小鼠肝脏组织RNA-sequence

Fig 5 Determination of FAS and NEFA in subcutaneous *P<0.05 #P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.3.1转录组测序与 De nove 组装 对各组小鼠肝脏组织中提取的总RNA分别测序得到原始图像数据，经base calling转化为原始序列数据(raw reads)，而后组装并去冗余，得到过滤后序列数据 clean reads,见Tab 1。

Tab 1 Summary of sequences analysis

2.3.2差异表达分析 对照组中，与C57BL/6J组相比较，TRPC5-/-组共检测到674个差异表达基因，上调差异基因(红色) 347个，下调差异基因(绿色)327个。高糖组中，与C57BL/6J组比，TRPC5-/-组共检测到差异基因1 022个，其中上调基因663个，下调基因359个。高糖组上调基因数明显多于对照组(P<0.05)，提示在高糖刺激下，TRPC5基因会影响其它相关基因，进而调节机体代谢平衡，差异基因火山图见Fig 6。

Fig 6 Volcano map of differentially expressed genes

2.3.3差异表达基因GO功能分析 选取差异基因富集数目占前10的内容(P<0.05)，发现：对照组在生物学过程中，较多的差异基因归类为细胞趋化性、有机酸生物合成及脂质定位；在细胞组成中，归类为膜筏、膜区以及血浆脂蛋白颗粒；在分子功能中，参与氧化还原酶、氧气及血红素结合的差异基因较多，见Fig 7。

Fig 7 Go function analysis of normal miceA:BP;B:CC;C:MF

高糖组在生物学过程中，较多的差异基因归类为嘌呤核苷酸代谢过程、氧化应反应及脂肪酸代谢过程；在细胞组成中，归类为线粒体内膜的差异基因最多；在分子功能中，较多的差异基因归类为核苷结合、小GTPase结合(P<0.05)，见Fig 8。

本结果证明，敲除TRPC5基因之后，对免疫及脂质转换过程有影响；高糖刺激下，影响则主要集中在核苷酸代谢及脂肪酸的代谢过程，提示TRPC5基因在糖脂代谢中扮演重要角色。

2.3.4差异表达基因KEGG功能分析 我们选取了差异基因富集数目较多的前10条通路(P<0.05)，发现：对照组中，差异表达基因较多的富集在吞噬体、视黄醇代谢通路；给予高糖刺激后，则较多的富集在代谢通路、产热、内分泌抵抗过程中，见Fig 9。提示TRPC5基因在糖代谢及产热过程中有重要作用。

Fig 9 Result of KEGG signaling pathwayA:Control;B:Sucrose

2.3.5差异表达基因关键基因筛选 通过使用Cytoscape中的CytoHuba插件可视化分析并计算出前100的关键基因，发现高糖刺激后，TRPC5基因核心排序从48位变为了16位，再次证明TRPC5基因影响糖脂转换，是潜在的糖尿病治疗靶标。

3 讨论

研究表明，代谢综合征(metabolic syndrome，MS)和胰岛素抵抗在T2DM和心血管疾病的发病机制中起主导作用[11]。代谢综合征是人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质代谢发生紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，同时也是导致糖尿病心脑血管疾病的危险因素。有研究证实非选择性的阳离子通道-瞬时受体电位通道(TRPCs)与代谢综合征的病理生理机制相关[12]，TRPC1、TRPC3、TRPC6三种亚型被敲除或者抑制后均可显著降低血糖[13]；且TRPC5与糖酵解有关，在化疗耐药治疗中扮演重要角色[14]。本研究中，在高糖刺激后，TRPC5基因可以一定程度抑制糖酵解，这一结果进一步证明了TRPC5基因与糖酵解的相关性，也为耐药机制的研究提供了思路。

本研究前期结果中，敲除TRPC5基因，对小鼠体重及血糖均有影响，推测TRPC5基因与肥胖及糖尿病可能有联系。我们通过给予小鼠高糖刺激，进一步对这一推测进行验证。结果表明，在高糖刺激下，与C57BL/6J小鼠相比，TRPC5-/-小鼠胰岛素分泌增加，TC含量减少，提示对于1型糖尿病患者，抑制其TRPC5基因可能会对其症状有所缓解；且高糖刺激下抑制TRPC5基因可使PFK含量增加，促进糖酵解，同时肝脏中ACC含量增加，促进脂肪酸合成，影响脂代谢过程，进而调控糖脂代谢过程。有研究报道，血脂代谢调节与脂质代谢调节在糖尿病发生发展过程中有影响[3,15]，本研究为了再次明确TRPC5在糖脂代谢中的重要作用，使用RNA转录组测序技术对肝脏组织进行分析。结果发现敲除TRPC5基因后，在高糖刺激下会影响体内其它基因上调，从而在糖脂代谢中起到作用。治疗糖尿病的药物二甲双胍也是通过调节多种代谢通路来达到降血糖效果的[15]，若能明确TRPC5的作用，则有助于研发新的通过调节代谢通路来治疗糖尿病的药物。

本文针对TRPC5在糖脂代谢中的影响进行了研究，为TRPC5成为治疗糖尿病及其他代谢类疾病的潜在靶标提供了实验依据。有关其发挥作用的详细分子机制及信号通路尚需进一步研究探讨。