枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢测量方法研究

隋志伟, 王 斌,, 刘思渊，王 晶,傅博强，卓婷烨, 王 义

(1.中国计量科学研究院，北京 100029；2.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118)

1 引 言

枯草芽孢杆菌是一种广泛分布于各种环境的生物防护细菌[1]，具有较强的分泌酶的特性，并且生长快、营养简单、耐酸、耐高温、耐胆盐、能快速复活[2]，在发酵工艺、植物病害防治[3]、环境污染治理[4]、牲畜养殖业等领域都有着长足的应用价值。枯草芽孢杆菌易培养、易保存，对人畜无毒无害，不产生环境污染，因此被作为理想的生物防护评价的指示菌。其中，枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC9372为主要的应用菌种。

枯草芽孢杆菌黑色变种宽0.5～1 μm，长2～4 μm，在胰蛋白胨大豆琼脂培养基呈圆形、光滑、不透明、红棕色或褐色菌落。由于枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC9372所产芽孢在抗干热等方面具有强抗性[5]，因此该菌在人员防护装备性能评价、消毒剂检测及灭菌质量控制方面已作为国际质量控制标准菌株被广泛应用。在美国、欧盟和我国的生物安全柜标准中均规定了要用枯草芽孢杆菌黑色变种作为其性能评价的指示菌，主要应用在人员防护、样品保护和交叉污染三个方面的测试[6～8]。英国、瑞士和我国等国家标准协会将该菌作为干热灭菌指示剂和其它液体化学消毒剂的指示剂列入与医疗器械相关的标准中。

枯草芽孢杆菌芽孢的精确定量测量是保证指示微生物量值准确的关键。本研究针对枯草芽孢杆菌涂布平板法进行了方法验证，同时选择8家实验室进行协同实验验证，建立了枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢测量方法，评价了方法的不确定度，为人员防护装备防护性能评价、消毒剂检测及灭菌质量控制提供了计量技术支撑。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

2.1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌黑色变种(bacillus subtilis var. niger)标准菌株(ATCC，菌株编号9372)由中国计量科学研究院保存。枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢方法验证样品由中国计量科学研究院研制。

主要试剂：胰蛋白胨大豆琼脂培养基、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，购自北京陆桥技术有限责任公司。

2.1.2 仪器与设备

HVE-50高压灭菌锅，日本Hirayama公司；HWS-400恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Milli-Q Advantage纯水仪，美国Millipore公司；CP225D电子天平，德国Sartorius公司；移液器 (1 000 μL, 100 μL, 200 μL)，德国Eppendorf公司。

2.2 方法

参考国家标准GB/T 26428—2010[9]，采用枯草芽孢杆菌涂布平板法测量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢浓度。

2.2.1 培养基制备

将胰蛋白胨大豆琼脂培养基粉末加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值(7.3±0.2)。分装至锥形瓶中， 121 ℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，摇匀后倾注平板。使用前在4 ℃冰箱储存不得超过48 h。

2.2.2 样品的稀释

将待测枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢冻干样品从4 ℃冰箱取出后，在室温下放置5 min，用移液器加入60 mL无菌的磷酸盐缓冲液作为稀释液进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液。再用1 mL移液器吸取S0样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中(注意吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1 mL无菌吸头反复吹打使其混合均匀，制成1:10的S1样品匀液。再用稀释液对充分溶解后的样品S1在经灭菌后的试管中进行10倍系列稀释，分别为S2，S3，S4，…，Sn，每递增稀释一次，换用一次1 mL无菌吸头，混匀要充分。

2.2.3 样品的接种

选择3个适宜稀释度的样品匀液，水浴(80±1)℃，维持10 min，每个稀释度分别吸取100 μL样品匀液接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板; 然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。涂布好的平板盖好，置室温中放置15 min，使接种物完全被琼脂吸收; 然后将平板倒置于培养箱，每个稀释度至少重复3次。

2.2.4 培养

涂布后，将平板静置10 min后，将平板倒置于培养箱后，(37±1) ℃培养，(48±2) h。

2.2.5 典型菌落计数和确认

枯草芽孢杆菌黑色变种在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上形成的菌落基本上是表面粗糙、呈扁平同心圆状的褐色或棕红色菌落。选择有典型的枯草芽孢杆菌黑色变种菌落且菌落数在30～300 CFU之间的平板，计数典型菌落数和记录稀释因子。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示，实验结果以芽孢浓度(CFU/mL)表示。

1) 若只有1个稀释度的平板菌落数在30～300 CFU之间,且有典型菌落; 计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算：

(1)

式中：C为枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢浓度；N为某一平板上枯草芽孢杆菌黑色变种典型菌落的总数；m为适宜范围菌落数的平板数；d为稀释因子；V为平板上枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬浮液接种体积。

2) 若有2个连续稀释度的平板菌落数均在 30～300 CFU之间，按式(2)计算：

(2)

式中：C为枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢浓度；N为某一平板上枯草芽孢杆菌黑色变种典型菌落的总数；m为第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n为第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d为稀释因子；V为平板上枯草芽孢杆菌黑色变种悬浮液接种体积。

2.3 枯草芽孢杆菌涂布平板法重复性验证

重复性被定义为在相同测量条件下，对同一被测量按方法规定的步骤，进行多次连续测量所得结果之间的一致性。这些条件称为重复性条件，它包括相同的测量程序、相同的观测者、在相同的条件下使用相同的测量仪器、相同地点、在短时间内重复测量。按照第2.2节方法中的描述的实验步骤对的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢样品采用涂布平板法进行测量。重复性验证时，每天重复测试枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢样品9次，连续测试5天，共得到45个测定结果，同时用无菌磷酸盐缓冲液做空白对照，培养后观察结果。标准偏差s用式(3)计算，相对标准偏差RSD用式(4)计算。

(3)

(4)

2.4 枯草芽孢杆菌涂布平板法协同验证实验

按照GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》[10]，选择通过ISO 17025或CNAS-CL01:2006认可，或经计量认证的8家实验室全部采用经实验组织方确认了的枯草芽孢杆菌涂布平板法进行方法的协同验证实验。

8家实验室通过预实验的分析合格后，每家实验室收到由组织实验室发放的5瓶枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢样品和标准操作程序(SOP)以及填写结果报告的表格后，按照第2.2节方法中的描述分别开展协同验证实验；并选择3位具有微生物实验操作经验的工作人员分别单独计数平板上出现的典型枯草芽孢杆菌黑色变种菌落，取平均值作为该平板的实验结果。通过计算将实验结果返回实验组织方后统计分析，先对各家实验室数据采用格拉布斯准则进行离群值检验[11]；再用科克伦(Cochran)法检查各组数据之间是否等精度[12]，采用式(5)计算室内标准偏差，采用式(6)和式(7)计算室间标准偏差，采用式(8)和式(9)计算重复性和再现性[13]。

(5)

室间变动性标准偏差sl为：

(6)

室间标准偏差sR为：

(7)

方法的重复性r为：

(8)

方法的再现性R为：

(9)

2.5 枯草芽孢杆菌涂布平板法的不确定度评定

枯草芽孢杆菌涂布平板法的不确定度uchar由两部分组成：第一部分是测量方法的A类标准不确定度uA；第二部分是测量方法的B类标准不确定度uB。

3 结 果

3.1 枯草芽孢杆菌涂布平板法室内重复性分析

采用建立的枯草芽孢杆菌涂布平板法，重复测试枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢样品9次，连续测定5天，共得到45个测定结果；同时用无菌磷酸盐缓冲液做空白对照，统计实验结果，按照式(3)和式(4)计算，结果见表1。

由表1可知，当平板上的菌落数在 30～300 CFU之间时，该方法的室内重复性为10.0%，满足微生物定量测量方法<30%的要求[14]，说明枯草芽孢杆菌涂布平板法具有较好的重复性，能够对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢进行准确的定量测量。

表1 枯草芽孢杆菌涂布平板法测量重复性结果(D=5，n=9)Tab.1 Repeatability of spread plate method for Bacillus subtilis (D=5, n=9) ×108 CFU/mL

3.2 枯草芽孢杆菌涂布平板法协同实验分析

当平板上的菌落数在30～300 CFU之间时，该方法的实验室内标准偏差sr为0.37×108CFU/mL，方法的重复性r为1.06×108CFU/mL，室内相对标准偏差RSDr 为8.9%，实验室间标准偏差sR为0.76×108CFU/mL，方法的再现性R为2.16×108CFU/mL，室间相对标准偏差RSDR为14.1%，可以达到微生物定量测量方法精度<30%的要求[14]。

表2 枯草芽孢杆菌涂布平板法协同实验结果(m=8，n=5)

3.3 枯草芽孢杆菌涂布平板法不确定度评定结果

枯草芽孢杆菌涂布平板法测量的不确定度主要由A类不确定度和B类不确定度组成[15, 16]。

3.3.1 A类相对标准不确定度urel(A)

A类不确定度分量uA是通过测量方法的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出的不确定度。采用枯草芽孢杆菌涂布平板法对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢样品重复测量9次。对测量数据采用格拉布斯准则进行离群值检验和正态性分析后，再用科克伦(Cochran)法检查各数据符合等精度要求，计算测量结果的算数平均值，用式(11)计算得出uA为0.15×108CFU/mL，A类相对标准不确定度用式(12)计算，如表3所示为urel(A)=2.78%。

(11)

A类相对标准不确定度urel(A)为：

(12)

表3 枯草芽孢杆菌涂布平板法A类不确定度评定(n=9)Tab.3 Type A uncertainty evaluation of spread plate method for Bacillus subtilis (n=9) ×108 CFU/mL

3.3.2 B类相对标准不确定度urel(B)

由式(1)或式(2)以及对测量过程的分析，B类相对标准不确定度主要来源包括[17, 18]：a)移液器带来的相对标准不确定度urel(V)；b)样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。按照式(13)合成B类相对标准不确定度，结果见表4。

(13)

3.3.3 合成不确定度urel(char)和相对扩展不确定度Urel

考虑到两部分标准不确定度相互独立，合成相对标准不确定度urel(char)用式(14)计算，相对扩展不确定度Urel用式(15)计算，结果见表4。

(14)

Urel=k·urel(char)

(15)

表4 枯草芽孢杆菌涂布平板法不确定度评定结果Tab.4 Uncertainty evaluation results of spread plate method for Bacillus subtilis

4 结 语

本文针对枯草芽孢杆菌涂布平板法进行了方法的室内验证和多家实验室协同验证，当平板上的菌落数在30～300 CFU之间时，该方法的室内重复性相对标准偏差为10.0%，室间相对标准偏差为14.1%，均达到了微生物定量测量方法精度<30%的要求，说明枯草芽孢杆菌涂布平板法具有很好的重复性和再现性，其相对扩展不确定度为12.0%。该方法适用于枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的定量测量，对于人员防护装备防护性能评价、消毒剂检测及灭菌质量控制具有重要意义。

致谢：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院、北京市疾病预防控制中心、北京市朝阳区疾病预防控制中心、北京市医疗器械检验所、山东省医疗器械产品质量检验中心、苏州市计量测试院、国卫康诚(北京)技术检测有限责任公司、上海华证联检测科技有限公司对协同验证实验研究工作提供了支持，谨致谢忱。