竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解及再生性能

吴文娟 邹春阳 黄丽菁 金永灿

(南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心 南京 210037)

木材和非木材植物纤维原料的主要化学成分为纤维素、半纤维素和木质素，占原料总质量的80%～95%，其中，木质素为高度交联的芳香族高聚物，具有胶黏作用，将纤维素和半纤维素相互连接在一起，并给予加固硬质化，以避免微生物侵蚀到细胞壁(Kammetal., 2006)。在木质素大分子结构中，作为木质素的基本单元，苯丙烷以醚键或碳-碳键的连接方式组成交叉网络的立体结构，作为大分子，其结构中也有以化学键的连接方式与碳水化合物结合在一起，形成具有立体网状结构的大分子，并以木质素-碳水化合物的复合物(LCC)形式存在于植物细胞壁中。木质纤维原料结构复杂致密，在生物或化学降解上具有明显抑制作用，且错综交织结构的存在也不利于分出全部原本木质素，从而无法获取到木质素的相关原始结构信息(Adler， 1977； Leeetal., 1981； Changetal., 1975)。因此，有效抑制或消除这种阻碍，对发展、实施木质纤维原料的高度生物炼制具有重大意义。

目前，对原本木质素的了解主要基于一些传统、经典的方法，如球磨木质素(MWL)、纤维素酶解木质素(CEL)，这些方法均需要一定程度的球磨处理，但球磨程度不同会导致木质素结构不可避免的破坏(Ikedaetal., 2002； Fujimotoetal., 2005； Huetal., 2006； Guerraetal., 2006； Holtmanetal., 2004)，将模糊对原本木质素最初结构的认识。尽管研究人员在这一方面做了大量工作，但通过分离得到的各组分会发生一定程度的降解或衍生化反应，使得供分析的各组分结构特征不具备完全公认的代表性。对于木质素所在载体——木质纤维原料，由于其本身组成结构复杂，要了解彼此之间的组成连接，当前除了合适的分离手段外，还可借助木质纤维原料的全溶体系，利用高分辨率二维核磁共振技术对细胞壁组分进行结构鉴定，分析速度快，且可获得更加全面的各组分结构信息。在全溶体系下，NMR的光谱分析可给出完整木质素的结构信息，这是分离出来的木质素无法提供的； 但并不是所有全溶体系都具有这样的特点，有些体系在溶解过程中可能会有衍生物生成(Kuboetal., 2008； Heinzeetal., 2000)，如有机溶剂复合体系二甲基亚砜/四丁基铵(DMSO/TBAF)，细胞壁组分在全溶体系中发生乙酰化反应后，会伴随其他组分的衍生； 有些全溶体系需要在苛刻条件下进行(Kilpeläinenetal., 2007)，如咪唑类溶剂，将木片完全溶解，需要在150 ℃下持续溶解24 h； 也可能与原料的球磨程度有关(Luetal., 2003)。这些都可能改变原料中各种初始化学组成的变化，从而会影响初始结构的信息收集。

LiCl/DMSO(氯化锂/二甲基亚砜)溶剂体系一直作为高聚物的反应溶剂(Petrušetal., 1995)。Wang等(2009)将该溶剂体系用于木材溶解，成功得到了不同于上述的木质纤维素全溶体系。LiCl/DMSO溶剂体系可有效改善球磨时间对木质素结构的影响，与其他木质纤维原料溶剂体系相比，该体系的最大优点是制备球磨样品时，球磨时间可缩短至2 h，且全溶时样品质量分数高达10%。LiCl/DMSO溶剂体系所得木质纤维素全溶组分能够直接用紫外、核磁共振等进行分析，相继用于稻草、麦草等非木材木质纤维原料的溶解以及木质素的分离和表征(Wuetal., 2014a； Guetal., 2015； Caoetal., 2016； Jiangetal., 2017)。本研究以竹材为原料，探索竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解行为及再生特点，以期为全面解析竹材原本木质素结构信息提供一个可行的木质素分离溶剂体系。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂 试验竹材——毛竹(Phyllostachysedulis)产自浙江安吉，人工劈成长3～4 cm，宽、厚 2～4 mm 的小竹条。风干后用Wiley微型粉碎机粉碎，取40～80目组分，用苯醇(2∶1，V/V)抽提8 h，经真空干燥后得脱脂竹粉(B)，贮存于带磨砂玻璃塞的广口瓶中，供分析使用。本研究所用试剂均为分析纯。

1.2 球磨 球磨采用德国Fritsch微型行星式高能球磨机。称取3 g真空干燥后的脱脂竹粉装入容积为45 mL的氧化锆制罐子中，内装18只内径1 cm的氧化锆球，在600 r·min-1下根据需要进行不同时间球磨。球磨在冷库(-20 ℃)进行，每运行15 min休停5 min，以避免过热。球磨竹粉经干燥后备用。

1.3 LiCl/DMSO溶剂体系的溶解 配制不同质量分数(2%、4%、6%、8%等)的LiCl/DMSO溶液。称取不同球磨时间的竹粉，在LiCl/DMSO溶剂体系中(室温)进行溶解处理。

1.4 LiCl/DMSO溶剂体系的再生 LiCl/DMSO溶剂体系处理脱脂原料的流程如图1所示。球磨竹粉在6% LiCl/DMSO溶剂体系中进行溶解处理，完全溶解后，整个混合体系全部转移到孔径50 Å、直径28 mm、透过分子量14 000的透析袋，并将透析袋浸没于水中，用去离子水透析，用AgNO3溶液检测有无Cl-来判断是否完全置换出LiCl/DMSO溶剂体系。袋内物料经冷冻干燥后得到球磨的再生原料(RB)。

图1 经LiCl/DMSO溶剂体系处理后的再生流程Fig.1 Procedure of regeneration by LiCl/DMSO

1.5 分析方法 1) 化学成分测定 木质素含量参照文献(Denceetal., 1992)方法测定。称取样品0.3 g(精确到0.000 1 g)，加入3 mL质量分数为72%的H2SO4，18～20 ℃下水解 3 h，期间定时搅拌，然后转入100 mL玻璃瓶中，加水将H2SO4稀释至质量分数4%，密封后置于灭菌锅(DSX-280B)内，121 ℃下水解 1.5 h。采用恒重的G3砂芯漏斗分离残渣和滤液，收集滤液测定酸溶木质素和高聚糖含量。残渣用热蒸馏水洗涤，滤液用质量分数10%的BaCl2检测无白色沉淀，在恒温干燥箱中105 ℃干燥至恒重，称量后转入马弗炉中 575 ℃灼烧至恒重，测定木质素中灰分含量。计算 Klason 木质素含量时扣除灰分含量。以质量分数4%的H2SO4为参比，用日本岛津公司UV-240紫外-可见分光光度计测定滤液在波长 205 nm处的吸光度，计算酸溶木质素含量。还原糖含量测定参照文献(Borchardtetal., 1970)。取滤液5 mL，加入内标1 mL肌醇溶液(1 mg·mL-1)，用饱和Ba(OH)2溶液调节pH至5.5，离心分离除去沉淀，加入20 mg NaBH4于清液中，静置24 h。加入1 mL醋酸，旋转蒸发至浆状，再加入甲醇继续蒸发至干，每次1 mL，连续3次。蒸干体系于105 ℃烘干15 min，以确保体系完全无水。加入1 mL乙酸酐后密封，120 ℃反应3 h。用日本岛津公司GC-14b气相色谱仪分析还原糖。气相色谱条件如下： 毛细管柱TC-17 (0.25 mm×30 m)； FID检测器； 柱温程序，220 ℃保留20 min，进样温度220 ℃，检测温度230 ℃。GC分析得到的单糖均转换为高聚糖。同时进行2次测定，取平均值。

2) 硝基苯氧化 木质素结构单元变化通过碱性硝基苯氧化分析。硝基苯氧化操作参照文献(Chen, 1992)。取样品40 mg于10 mL不锈钢制罐子内，依次加入硝基苯0.25 mL、2 mol ·L-1NaOH 4 mL，将上述混合体系密封置于170 ℃油浴中反应2 h。冷却至室温，加入1 mL 0.1 mol ·L-1NaOH配制的内标3-乙氧基-4-羟基苯甲醛(0.2～0.4 g·L-1)。用二氯甲烷萃取3次，每次15 mL，弃油相取水相，用4 mol ·L-1HCl调节pH至1，再用二氯甲烷萃取2次，每次20 mL，乙醚1次，15 mL。收集有机相共55 mL，用20 mL去离子水洗涤有机相，经无水Na2SO4干燥，过滤，滤液蒸发至干，加入100 μL N, O-双(三甲基硅)乙酰胺衍生化试剂(BSA)100 ℃反应10 min，产物用日本岛津公司GC-17A气相色谱仪进行分析。气相色谱条件如下： 毛细管柱NB-1 (0.25 mm×30 m)； FID检测器； 柱温程序，150 ℃保留15 min，以3 ℃·min-1升温到180 ℃，继而以10 ℃·min-1升温到280 ℃，保留5 min； 进样温度250 ℃，检测温度280 ℃。同时进行2次测定，取平均值。

3) X射线衍射 纤维结晶指数分析在日本理学Ultima IV组合型多功能水平X射线衍射仪上进行，采用粉末法。测试条件： X光管为CuKα靶(λ=0.154 18 nm)，用石墨单色器消除CuKα辐射，管电压40 kV，管电流40 mA，采用θ/2θ联动扫描，索拉狭缝0.04 rad，接收狭缝0.15 mm，发射和防散射狭缝1°，扫描范围2θ=5°～40°，扫描步长0.02°，扫描速率5(°)·min-1，记录“衍射强度-2θ”曲线。

结晶指数根据Segal公式(Segaletal., 1959)计算，如下：

式中： CrI为结晶指数；Iamorph为 2θ为18°时无定形区衍射峰强度；I002为主结晶峰 002 的最大衍射强度。

2 结果与讨论

2.1 竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解性能 1) 不同球磨时间对竹材溶解性能的影响 图2为不同球磨时间竹粉(质量分数7.5%)室温下搅拌6 h后在6% LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解性能。可以看出，球磨时间不同，竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解性能亦有所不同。未球磨的40～80目竹粉，在LiCl/DMSO溶剂体系中呈现混浊且有分层状态，球磨0.5 h、1 h的竹粉不能完全溶解在6% LiCl/DMSO溶剂体系中，而球磨1 h的稻麦草能在该溶剂体系中完全溶解(Wuetal., 2014b； Guetal., 2015)； 进一步球磨发现，球磨2 h的竹粉能在该溶剂体系中彻底溶解，可得到澄清透亮的溶液。相较于稻草原料，竹材材质更为紧致，接近于木材。LiCl/DMSO作为再生纤维的溶剂体系，其中LiCl在溶解再生纤维素时具有破坏纤维素氢键并阻止重构氢键的作用，以此促进再生纤维素进一步溶解(Petrušetal., 1995)。该溶剂体系虽然不适用于一般纤维素溶解，但在原料选择上有进一步拓宽，即可作为球磨木粉的新型溶剂。与木材相比，禾草类纤维虽然有着化学成分、化学结构上不一样的特点，但基于一定条件，非木材在该溶剂体系中仍具有类似的溶解性能。

图2 不同球磨时间的竹材溶解性能(6% LiCl/DMSO)Fig.2 Effect of milling time in 6% LiCl/DMSO solvent system on dissolution for bamboo

2) LiCl/DMSO溶剂体系质量分数对竹材溶解性能的影响 图3为球磨2 h的竹粉在不同质量分数LiCl/DMSO溶剂体系中的溶解性能。可以看出，随着LiCl/DMSO溶剂体系质量分数增加，球磨竹粉在其中的溶解度亦随之增加。球磨2 h的竹粉能够完全溶解于6% LiCl/DMSO溶剂体系中，溶解后体系透明澄清，可溶解竹粉的上限量为7.5%(在LiCl/DMSO体系中的质量分数)。随着LiCl/DMSO溶剂体系质量分数增加，球磨2 h的竹粉溶解度增大，在8%LiCl/DMSO溶剂体系中可溶解竹粉的质量分数达10%。与木材相比，LiCl/DMSO溶剂体系更易于溶解非木质纤维原料，可降低球磨时间及所需的溶解时间。

图3 不同质量分数LiCl/DMSO溶剂体系的竹材溶解性能Fig.3 Effect of LiCl content in LiCl/DMSO solvent system on dissolution for bamboo

2.2 竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中的再生性能 1) 再生竹材的化学成分 竹材在LiCl/DMSO溶剂体系中具有与木材类似的溶解性能，得到再生竹材的主要化学成分见表1。可以看出，再生竹材中Klason木质素有少许下降，这是因为经LiCl/DMSO溶剂体系处理后的竹粉在水中再生时采用的是孔径50 Å、透过分子量14 000的透析袋，一些小分子量、小孔径的成分会在再生过程中透过透析袋，进入到水中，最终被移除。相较于原料中的Klason木质素，球磨2 h的竹粉中Klason木质素下降3.2%，而酸溶木质素在LiCl/DMSO溶剂体系溶解再生过程中没有变化。球磨2 h的竹粉中木质素得率比脱脂竹粉低10%，高聚糖得率为85%，球磨和LiCl/DMSO溶剂体系溶解再生对原料中高聚糖含量具有一定影响。经LiCl/DMSO溶剂体系处理，再生后竹材可更多地保留化学成分，其中高聚糖溶出量比木质素多，相较于在同样溶剂体系中的球磨稻草粉(Wuetal., 2014b)、木粉(Wangetal., 2009)，竹材在溶解性能上更接近于木材。

表1 再生竹材的主要化学成分(基于原料)Tab.1 Chemical compositions of bamboo and regenerated bamboo (based on raw materials)

2) 再生竹材木质素结构单元的变化 木质素结构中存在愈疮木基丙烷、紫丁香基丙烷和对-羟基苯基丙烷3种类型的结构单元。针叶材木质素主要以愈创木基丙烷为主，阔叶材木质素除愈创木基丙烷外，还有较多的紫丁香基丙烷，禾草类木质素则是愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和对-羟基苯丙烷3种结构单元的混合物。木质素碱性硝基苯氧化产物可揭示木质素苯环单元构成，表2给出了球磨竹粉经LiCl/DMSO溶剂体系处理再生后硝基苯氧化产物得率及木质素结构单元变化。可以看出，虽然同属于禾草类，但竹材在木质素化学结构上却有着与稻草不一样的特点，木质素中紫丁香基单元含量占3种结构单元之和的一半。与未经任何处理的原料竹材相比，球磨2 h的竹粉化学结构单元几乎没有变化，再生原料的硝基苯氧化产物得率及各结构单元含量经过球磨、LiCl/DMSO溶剂体系处理后也几乎没有变化。脱脂竹粉的硝基苯氧化产物包括对羟基苯甲醛(H)、香草醛(V)和紫丁香醛(S)，总得率为2.5 mmol·g-1，其中S单元占50%，与文献中竹材木质素结构单元含量及分布一致(黄曹兴等, 2018)； 竹粉经球磨、再生处理后，硝基苯氧化产物得率为2.4 mmol·g-1，S单元仍为50%，均高于稻草的得率(Wuetal., 2014b)，即木质素的缩合程度不及稻草。由此可知，球磨及LiCl/DMSO溶剂体系处理对原料中木质素结构均没有影响。

表2 竹材硝基苯氧化产物的得率及S/VTab.2 Nitrobenzene oxidation products yields and S/V molar ratio of bamboo samples

图4 竹材原料(B)和再生原料(RB)的X射线衍射分析Fig.4 X-ray pattern of original bamboo and regenerated bamboo with ball milling

3) 再生处理对竹材纤维素结晶度的影响 图4为竹材原料及经球磨、LiCl/DMSO溶剂体系处理后再生原料的X射线衍射曲线，表3为竹材原料和再生原料纤维素的结晶度。可以看出，球磨2 h并经LiCl/DMSO溶剂体系处理后再生原料的衍射曲线明显不同于竹材原料，结合表3，原料再生后的结晶度由原来的58.7%降低至26.5%，说明LiCl/DMSO溶剂体系处理球磨原料会影响原料中纤维素的聚集态结构。纤维素本身结构复杂，内部存在大量的晶区结构、非晶区结构和氢键，溶剂对纤维素的可及度低，一般溶剂难以溶解，球磨后经LiCl/DMSO溶剂体系处理，会使原料中原有的结晶区域有一定程度破坏，从而有利于球磨竹粉在LiCl/DMSO溶剂体系中进一步溶出，同时LiCl/DMSO溶剂体系作为预处理所带来的结晶区改变，有望达到提高酶解效率的作用。

表3 竹材原料和再生原料纤维素的结晶度Tab.3 Crystallinity of bamboo and regenerated bamboo with ball milling

3 结论

球磨2 h的竹粉能以质量分数7.5%完全溶解在6%LiCl/DMSO溶剂体系中，溶于8%LiCl/DMSO溶剂体系中的竹粉质量分数达10%； 再生后，球磨竹粉的化学成分再生能力强，木质素得率约90%，高聚糖在6%LiCl/DMSO溶剂体系的再生能力稍低于木质素。竹材中木质素的缩合程度低于稻草，球磨及再生对竹材木质素结构没有影响。竹材原料球磨再生后的纤维结晶区有一定程度破坏，结晶度有所下降。竹材无论是化学成分还是生物结构均与木材类似，在溶解性能上更接近于木材。基于LiCl/DMSO溶剂体系的木质素分离不会破坏竹材木质素的化学结构，同时有助于提高竹材木质素组分的分离效果。