HJURP基因多态性与晚期肝细胞癌奥沙利铂为基础化疗疗效及不良反应的相关性

韦玲春 廖小莉 黄文锋 廖思娜刘志辉 李永强

原发性肝癌是我国最常见的癌症之一，其中90%为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。广西是肝癌高发地区之一，其发病率和死亡率在广西恶性肿瘤中分别位居第二位和第一位［1］。肝癌起病隐匿，症状不典型，确诊时大多已为中晚期，错失手术治疗的最佳时机。晚期肝癌治疗中索拉非尼等分子靶向药物取得一定疗效，但因费用昂贵、部分患者难以耐受等限制了其临床应用［2-3］。传统化疗药物阿霉素、丝裂霉素等不良反应显著，且未能改善生存期［4］。QIN等［5］研究结果证实以奥沙利铂为主的方案可为亚洲患者，特别是我国晚期HCC患者带来生存获益，成为晚期肝癌一线系统化疗的标准治疗。

DNA修复通路相关基因多态性被认为是影响含铂类方案治疗疗效的重要因素［6］。Holliday交叉识别蛋白（holliday junction recognition protein，HJURP）是近年来新发现的一个基因，在DNA修复、维持染色体稳定中具有重要意义［7-8］。研究表明，HJURP基因在肿瘤发生发展中起重要作用［9］，在肺癌、肝癌、乳腺癌等组织中的表达高于正常组织［10-12］，且HJURP基因rs3771333位点多态性可能与我国肝癌遗传易感性相关［13］，但HJURP基因多态性与HCC治疗疗效及预后的关系尚未明确。本研究探讨HJURP基因多态性与含奥沙利铂方案一线治疗晚期HCC近期疗效、预后及不良反应的关系，为HCC患者的预后评估寻找新的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月—2019年4月在广西医科大学附属肿瘤医院治疗的HCC患者为研究对象。纳入标准：⑴经病理组织学或临床诊断为HCC；⑵无手术指征或拒绝手术及介入等局部治疗；⑶化疗前ECOG评分为0～2分，均无化疗禁忌证；⑷TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；⑸自愿接受含奥沙利铂方案的化疗并签署化疗同意书。排除标准：⑴合并其他严重基础疾病或严重多器官功能障碍者；⑵合并其他恶性肿瘤；⑶入组前曾接受其他系统治疗，如靶向治疗及免疫治疗等。本研究获广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方案及剂量调整方法

入组患者接受含奥沙利铂联合方案化疗：奥沙利铂130 mg/m2，第 1 天；替吉奥 40 mg/m2，分 2 次口服，第1～14天。化疗期间常规予5-羟色胺3受体（5-HT3R）止吐，若治疗周期中血液学检测显示剂量限制性毒性，则暂停治疗，予粒细胞集落刺激因子等治疗。

1.3 DNA提取

所有患者均在接受含奥沙利铂方案化疗前空腹抽取5 mL外周静脉血，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明提取总DNA，并将提取完成的DNA进行质控，Qubit荧光定量进行DNA浓度定量，琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度分析，符合要求的DNA样本存于-20℃冰箱中备用。

1.4 基因分型

样本完成提取后将基因组DNA片段化，进行末端修复，在DNA片段两端加上已知序列的接头并引入index标签构建成为测序引物可识别的的全基因组DNA文库；然后将DNA文库与探针进行杂交，探针为标记有生物素的单链DNA，用于捕获与其互补的靶序列，杂交孵育完成后，加入链霉素标记的磁珠，捕获靶序列，通过洗脱反应去除非靶区域序列及其他杂质，得到含靶区域捕获产物的文库；最后将杂交洗脱后的样本按照数据量比例进行混合并测序。数据通过过滤、比对、质控后进行突变检测。

1.5 疗效和不良反应评价

采用实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版［14］进行疗效评价，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）、疾病进展（PD），其中疾病控制率（DCR）=［（CR+PR+SD）/总例数］×100%。无进展生存期（PFS）定义为从化疗开始到肿瘤发生进展或因任何原因死亡的时间。总生存期（OS）定义为从化疗开始至死亡的时间。根据美国国家癌症研究所（NCI）提出的不良事件术语标准4.0版（CTCAE 4.0）［15］进行分级评价不良反应。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。分类资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；采用Logistic回归模型分析HJURP基因多态性与疾病控制率的关系，并校正潜在的混杂因素；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存分析。所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者的基线资料

共42例晚期HCC患者符合标准纳入研究，中位年龄 46岁（范围：20～68岁）；男性 35例，女性 7例。其余资料详见表1。

表1 42例晚期HCC患者的临床资料Tab.1 Characteristics of 42 patients with advanced HCC

2.2 基因分型结果

所有样本均分型成功，入选位点基因分型均符合染色体 Hardy-Weinber遗传平衡规律（P＞0.05），基因频率分布见表2。

2.3 HJURP基因多态性与疾病控制率的关系

42例患者中获PR 1例（2.4%）、SD 8例（19.0%）、PD 33例（78.6%）、DCR为21.4%。由于rs10511位点G/G型例数较少，将A/G+G/G合并分析，同理将rs12582位点C/T+T/T型、rs3821238位点C/G+G/G型、rs3732215位点C/G+G/G型、rs3806589位点G/A+A/A型、rs2286430位点G/A+A/A合并分析。结果显示，HJURP基因各位点与DCR无明显关系（均P＞0.05）。见表3。

表2 42例晚期HCC患者基因频率分布Tab.2 Genotype distribution of 42 patients with advanced HCC

2.4 HJURP基因多态性与PFS及OS的关系

通过住院、门诊复查或电话随访，随访截至2019年12月31日，中位随访时间为5个月（范围：2～70个月）。至随访结束，42例患者中，6例存活，34例死亡，2例失访。全组患者中位无进展生存期（mPFS）为1.5个月（95% CI：1.3～1.7个月）；中位总生存期（mOS）为4.4个月（95% CI：2.1～6.7个月）。rs3771333位点A/A基因型患者mOS为6.0个月（95% CI：1.4～10.6个月），A/C基因型为 1.3个月（95% CI：0.0～3.8个月），A/A 基因型患者mOS较A/C型患者延长4.7个月，差异有统计学意义（χ2=5.819，P=0.016），见图 1。其余位点各基因亚型间的mPFS及mOS的差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 4。

表3 HJURP基因多态性与DCR的关系Tab.3 Relationship between HJURP polymorphism and DCR

2.5 HJURP基因多态性与化疗不良反应之间的关系

所有患者主要不良反应主要为血液学毒性、神经毒性、胃肠道毒性等，以Ⅰ～Ⅱ度为主，且经对症治疗后均可缓解，未影响后续治疗。其中贫血发生率最高（50%），但也以轻度为主，仅1例发生Ⅳ度贫血，经输血等治疗后贫血得以改善，未影响后续治疗，其余不良反应分布情况见表5。发生血液毒性组（G1～4）与未发生血液毒性组（G0）比较，以及发生轻度（G1～2）与中至重度（G3～4）血液毒性组比较，各基因型频率在各组内的差异无统计学意义（P＞0.05）。发生胃肠道毒性（G1～4）与未发生胃肠道毒性组（G0），以及发生神经毒性组（G1～4）与未发生神经毒性组（G0）中，各基因型的频率差异也无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

DNA修复基因多态性与DNA修复能力相关，可影响含铂类方案化疗疗效及预后［9］。HJURP是近年新发现的一个基因，在DNA损伤修复中起重要作用。真核生物DNA双链损伤时，Mre11-Rad50-NBS1（MRN）复合体可感应断裂的产生，可快速聚集、包绕DAN双链断裂部位，为双链断裂的修复提供框架平台。且HJURP与MSH5/NBS1相互作用参与了DNA双链断裂修复［7］。目前也有研究报道HJURP与肝癌的关系，HU等［11］检测了164例肝癌患者组织样本中的HJURP蛋白表达水平，经多因素分析证实，HJURP高表达是不良预后的独立危险因素。本课题组前期的研究结果发现HJURP中rs3771333位点多态性可能与中国人肝癌易感性有关，携带C等位基因型为高危易感基因型［13］。本研究发现携带rs3771333位点A/A型的患者mOS较A/C型明显延长，提示携带C等位基因型可能与不良预后相关。HJURP基因rs3771333位点多态性表现为编码HJURP蛋白第568个氨基酸密码子的第3个碱基发生A→C转换，相应密码子由GAA转化为GAC，使其编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）转化为天冬氨酸（Asp）。由于不同氨基酸的理化性质及生物学功能不同，所以这种改变可能导致HJURP蛋白功能的改变，进而影响疾病易感性和预后。但本研究未发现该位点多态性与患者的DCR有关，可能原因为入组的病例数偏少、选择纳入校正的因素及数量影响了统计结果。

表4 HJURP基因多态性与PFS及OS的关系Tab.4 Relationship between HJURP polymorphism and PFS and OS

图1 rs377133位点各基因亚型患者总生存曲线Fig.1 Overall survival curves of gene subtypes of rs377133

表5 42例HCC患者不良反应发生情况［n（%）］Tab.5 Adverse effects in 42 patients with HCC［n（%）］

奥沙利铂引起的不良反应可致使患者化疗耐受性降低，一定程度上限制了化疗药物剂量从而影响化疗疗效。因此，筛选用于预测化疗毒性作用的生物学分子，对化疗前及化疗期间采取积极的相应干预措施，以预防化疗相关的严重不良反应的发生具有重要作用。目前以DNA修复基因多态性作为预测化疗不良反应的生物标志物成为研究的热点之一，但各研究结论并不一致，尚存争议。CORTEJOSO等［16］研究ERCC1基因C118T位点多态性与结直肠癌患者奥沙利铂化疗不良反应的关系，结果显示携带T等位基因型患者发生中性粒细胞减少的风险较低。但CHEN等［17］报道ERCC1基因C118T位点多态性与血液毒性无明显相关性。本研究中不良反应以轻度为主，且未发现HJURP基因多态性与晚期HCC患者血液毒性、胃肠道毒性及神经毒性发生相关。造成阴性结果可能与本研究样本量较少、入组患者的病因背景不同有关，同时患者的年龄、给药剂量、化疗前预处理方式等不同也可能造成结局的多样性，后续仍需综合考虑上述因素的影响，扩大样本量特别是增加有乙肝、肝硬化背景的患者进一步研究。此外，铂类药物在体内的代谢过程往往是多个基因共同作用的结果，除了与DNA修复基因相关外，代谢酶及转运酶等基因也具有重要作用，因此多基因多态性联合分析可能是未来铂类药物相关不良反应的研究方向。

综上，本研究发现HJURP基因多态性在晚期HCC以奥沙利铂为基础化疗的疗效评估中具有潜在的价值，可为晚期HCC的个体化治疗提供依据。但本研究病例数较少，且患者均来自于同一医院，存在选择偏倚情况，相关结论仍有待扩大样本量进一步研究。