碱性蛋白酶酶解血液蛋白的工艺优化

蔡新东，马石霞，冉权，马咸莹，王致远，张海霞，丁功涛*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124；2.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030）

我国是畜禽养殖大国，每年都有大量的畜禽被宰杀。据国家统计局数据可知，2019年，我国的生猪的出栏量超过7亿头，占世界总产量近50%；各类家禽出栏量超过130亿羽；牛出栏量超过5500万头，羊出栏量超过2亿头[1]。畜禽血液是畜禽屠宰加工的主要副产物，我国每年畜禽屠宰所产生的血液总量可超过80万吨，血液含有丰富的蛋白质、维生素、微量元素、矿物质等[2]。但是由于屠宰分散、技术落后、血液不易保存等原因，我国对畜禽血液的利用率还很低，每年屠宰的畜禽，只有1/4的血液进行合理利用[3]，而绝大多数作为废弃物进行了排放，因而造成了严重的环境污染。

目前，我国利用畜禽血液生产生物制剂、蛋白饲料、添加剂、工业原料以及直接食用[4-5]。在生产生物制剂方面，主要用于生产一些血红素铁、血红蛋白肽、血纤维蛋白原、凝血酶等医疗保健产品；在生产蛋白饲料方面，主要将畜禽血液作为原料，进行发酵，陈宇等采用复合菌株对猪血进行发酵，发酵产品血腥味很淡，营养丰富，蛋白质含量达到了69%，还含有多种游离氨基酸和微量元素[6]。张滨等采用多菌种发酵血液产品，得到的产物中可溶性蛋白含量达到20%以上，并产生了浓郁的香气[7]。

利用蛋白酶，可以将血液蛋白降解为利于动物消化吸收的多肽、小肽和氨基酸等。与游离氨基酸或全蛋白相比，动物对二肽和三肽形式的蛋白质吸收效率更高，并且二肽和三肽形式的蛋白质可能会改善饮食成分的吸收[8-9]。因此，将血液蛋白酶解并制成动物饲料，是解决废弃血液的一个方向。本研究以无菌牛血为底物，用碱性蛋白酶酶解血液，通过单因素试验和正交试验优化酶解工艺参数，旨在为屠宰场处理废弃血液提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛牛血（加入10%柠檬酸钠抗凝，采于甘肃省临夏州临夏市枹罕镇罗家堡村屠宰场），碱性蛋白酶（200000U/g，河南新仰韶生物科技有限公司），氢氧化钠、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸、甲醛均为分析纯，天津市百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解温度对牦牛血液蛋白水解度的影响

将牦牛血用蒸馏水稀释成蛋白质浓度为8%的溶血液[11]，在3%的酶浓度、pH为9.0、时间为5h、温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的条件下进行酶解，然后测定酶解溶液的水解度[10]。

1.2.2 酶浓度对牦牛血液蛋白水解度的影响

将牦牛血用蒸馏水稀释成蛋白质浓度为8%的溶血液，在pH为9.0、时间为5h、温度为55℃、酶浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%的条件下进行酶解，然后测定酶解溶液的水解度[12]。

1.2.3 酶解时间对牦牛血液蛋白水解度的影响

将牦牛血用蒸馏水稀释成蛋白质浓度为8%的溶血液，在5%的酶浓度、温度为55℃、pH为9.0、时间分别为2h、3h、4h、5h、6h的条件下进行酶解，然后测定酶解溶液的水解度[13]。

1.2.4 pH对牦牛血液蛋白水解度的影响

将牦牛血用蒸馏水稀释成蛋白质浓度为8%的溶血液，在5%的酶浓度、温度为55℃、时间为4h、pH分别为8、9、10、11、12的条件下进行酶解，然后测定酶解溶液的水解

度[14]。

1.2.5 碱性蛋白酶水解血液蛋白的正交试验

根据单因素试验结果，选择酶解温度、酶浓度、时间、pH作为试验因素，以血液蛋白水解度为指标设计正交试验[15]，采用L9（34）的正交试验表研究碱性蛋白酶酶解牦牛血液蛋白的各种因素对水解度的影响，各因素均取3水平，试验因素水平见表1。记录实验结果，利用SPSS和Origin2016软件对实验数据进行分析。

表1 正交试验因素水平表

1.2.6 主要指标测定方法

血液中总氮含量的测定：采用凯氏定氮法测定[16]。

式中：

X：试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g）。

V1：试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）。

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）。

c：硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）。

0.0140：1.0mL硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000mol/L]或盐酸[c（HCl）=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（g）。

M：试样的质量，单位为克（g）。

V3：吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）。

100：换算系数。

酶解液中氨基态氮含量的测定：采用甲醛电位滴定法测定[17]。

式中：

X：试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百毫升（g/100mL）。

V1：测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）。

V2：试剂空白实验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）。

c：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）。

0.014：与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[c（NaOH）=1.000mol/L]相当的氮的质量，单位为克（g）。

V：吸取试样的体积，单位为毫升（mL）。

V3：试样稀释液的取用量，单位为毫升（mL）。

V4：试样稀释液的定容体积，单位为毫升（mL）。

100：单位换算系数。

水解度的计算：水解度（%）=（氨基酸态氮/样品中总氮）×100[18]。

2 结果与分析

2.1 温度对血液蛋白水解度的影响

由图1可知，当温度从40～55℃时，水解度随着温度的升高而不断加大；当温度从55～60℃时，水解度随温度的升高而降低，且在55℃下出现最大水解度，故55℃设定为正交试验的酶解温度。温度升高时，酶的催化速度加快，但酶蛋白变性失活的速度也在不断增加，同时过高的温度也会使底物蛋白发生变性，影响酶的催化速度[19]。

2.2 酶浓度对血液蛋白水解度的影响

由图2可知，当酶浓度从1%～5%时，水解度随着酶浓度的升高而不断加大；当酶浓度大于5%时，水解度反而降低，故将5%设定为正交试验的酶浓度添加量。酶浓度直接影响酶解过程的效率，酶浓度的增加一般可提高蛋白质的水解度，但当酶浓度大于最适浓度时，其作用效果不会明显提高，甚至引起酶自溶增强，从而不利于酶解[20]。

2.3 时间对血液蛋白水解度的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度不断提高；当时间超过4h时，水解度上升的不明显，甚至略微下降，故4h设定为正交试验中的酶解时间。酶解时间的延长能提高血液蛋白的水解度，但长时间的酶解过程中，酶会将氨基酸降解为生物胺类物质，导致游离氨基态氮含量降低[21]。

2.4 pH对血液蛋白水解度的影响

由图4可知，pH7-11时，随着pH值增大，血液蛋白的水解度先升高后逐渐降低，当pH为9时，水解度最高，故将9设定为正交试验的pH值。pH值可改变酶与底物的荷电状态，从而影响酶的活性。酶的最适pH值受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲剂的种类和浓度及抑制剂等因素的影响[22]。

2.5 碱性蛋白酶水解血液蛋白正交试验和极差分析结果

碱性蛋白酶水解血液蛋白正交试验和极差分析结果见表2。极差分析结果表明，时间对酶解液的水解度影响较大，各因素对水解度影响程度依次为时间、温度、酶浓度、pH值。从K值可知较佳的工艺条件是A2B3C3D2，即酶解温度55℃、酶浓度6%、时间5h、pH9.0，此条件下，血液蛋白的水解度可达21.32%。

表2

3 结语

本研究以无菌牛血为原料，利用碱性蛋白酶进行牛血的酶解工艺研究，以水解度为指标，对酶解工艺中的温度、酶浓度、时间和pH进行单因素试验，并在此基础上进行正交优化试验，得到优化的酶解工艺条件为温度55℃、酶浓度6%、时间5h，pH9.0，此时的水解度为21.32%。本研究探索了碱性蛋白酶水解血液蛋白的优化酶解条件，为废弃血液蛋白的处理提供了参考。