灵芝发酵菌丝提取物组成成分与急性毒性分析

王英燕，贾存江，张 羽，徐国华，袁 峰，耿 燕

(1.江苏神华药业有限公司，江苏 淮安 211600；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122)

灵芝(Ganodermalingzhi)，担子菌门担子菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属真菌，是我国中医药宝库中的珍贵药物。目前，东南沿海、长江中下游等地区是我国最主要的灵芝种植区。我国现存最早的药学专著《神农本草经》中记载：“灵芝可明目，补肝气，安精魂，坚筋骨”[1]。经现代医学证明，灵芝具有多种药理活性，具有提高免疫力、保护放化疗损伤、抗肿瘤等多种功能[2]。灵芝作为药物已被《中华人民共和国药典》收录，临床上主要用于治疗肿瘤、慢性支气管炎、冠心病、神经衰弱、高血脂和高血压等疾病[3]。灵芝也属于国家批准的新资源食品，可以药食两用。目前灵芝可作为药品和保健品研发应用中的主要药用部位为其子实体[4]。但野生采摘或人工栽培子实体易受自然条件限制，生产效率低，产品质量波动大，其生产规模和科技含量也远未达到市场需求，因此对于灵芝产品的研究和开发仍有待于进一步深化[1]。近年来，采用液态发酵技术获得灵芝有效成分的研究取得了显著进展[5]，可实现其规模化量产，是解决上述问题的重要替代路径[6]。

灵芝主要活性成分包括灵芝多糖、三萜和灵芝酸等[7]。灵芝提取物是指以赤芝(GanodermalucidumLeyss.ex Fr.)或紫芝(GanodermasinenseZhao,Xu et Zhang)子实体为原料，经提取分离制成的水提物，由于其富含灵芝的主要活性成分，在药品、保健品、化妆品行业中应用广泛[8]。目前发现灵芝子实体与其菌丝体的营养成分十分相似，对人体同样有功效作用[9]。但对于灵芝菌丝体的研究还较少，有待进一步探索。本文中，笔者主要对灵芝发酵菌丝提取物(Ganodermalingzhimycelium extract,GLME)中的主要化学成分以及其急性毒性进行分析，以期为灵芝资源的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品

灵芝液态发酵菌丝体及菌粉制备：按文献[10]方法制备川芝4号液态菌丝体。并将制备好的菌丝体经60 ℃干燥，破碎，过150 μm筛制备成川芝4号菌粉。

GLME制备：取制备好的川芝4号菌粉500 g，加入5倍的纯化水，(82±2)℃提取3 h，提取液冷却至约40 ℃，8 000 r/min离心3 min。将过滤的滤渣继续加入5倍纯化水，于(82±2)℃提取3 h，将提取液冷却至约40 ℃，6 000 r/min离心5 min。将两次浸提的滤液减压浓缩(温度为60 ℃，真空度为0.09 MPa)至滤液体积0.2倍，缓慢加入5倍体积分数为95%乙醇，静置过夜，将沉淀物烘干即得GLME。

1.1.2 实验动物

昆明小鼠40只(雌雄各半)。其中雄性小鼠体质量为28.5～33.8 g，雌性小鼠体质量为23.3～27.8 g。实验小鼠均饲养在SPF级环境中，实验过程中以标准饲料喂养。

1.1.3 仪器及试剂

使用仪器及试剂参照文献[11]。

1.2 方法

1.2.1 一般性成分分析

按国家标准对GLME的灰分[12]、水分[13]、总蛋白[14]、粗脂肪[15]和粗纤维[16]进行分析。

1.2.2 矿质元素分析

按国家标准[17]对GLME中的矿质元素进行分析。

1.2.3 脂肪酸组成分析

按国家标准[18]采用气相色谱法对GLME中的脂肪酸进行分析。

1.2.4 氨基酸组成分析

取4 g GLME按文献[11]方法对样品进行前处理，随后采用高效液相色谱法(HPLC)对其中的游离氨基酸进行分析。按国家标准[19]对GLME中的水解氨基酸进行测定分析。

1.2.5 核苷类物质分析

取3 g GLME样品按文献[11]方法处理并采用HPLC进行分析。

1.2.6 粗多糖分子量分布及单糖组成分析

取2.5 g GLME样品按文献[11]方法制备粗多糖和游离单糖，并分别采用HPLC和红外光谱法(IR)进行分析。

1.2.7 急性毒性分析

GLME溶液配制：以0.5%的羧甲基纤维素钠为溶剂，分别配制5、50、200、500 mg/mL的GLME溶液(浑浊液)。实验组别设置：40只实验小鼠，雌雄各半，各随机分为4个剂量组(50、500、2 000、5 000 mg/kg)和1个溶剂对照组(每组8只，即n=8)，雌雄共8组。实验结束后，解剖前12 h做禁食处理。并按文献[11]方法开展急性毒性实验并进行样品处理及数据分析。

2 结果与讨论

2.1 一般性成分结果

GLME中粗脂肪、粗纤维、灰分、水分和总蛋白的质量分数分别为(10.88±0.86)%、(6.72±0.12)%、(12.87±0.84)%、(5.26±0.06)%和(14.35±0.74)%。

2.2 矿质元素

GLME中含有多种人体必需的微量元素(图1)，如Mn、Mg、Fe、Ca、K等，它们对细胞生长和机体的正常生长发育等起着重要作用[20]。其中K的含量较高，有利于维持机体的酸碱平衡，预防高血压。人体内Zn/Cu的质量比过高时会增加血液中胆固醇的含量，GLME中Zn/Cu比为1.26，明显低于植物性食物中所含的相应比值11.4。另外，样品中的铅、砷、镉等有毒元素的含量较低，符合国家保健(功能)食品通用标准(GB16740—1997)[21]。

Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Sn、Ba、Pb含量单位为mg/g，Mg*、Al*、K*、Ca*、Fe*含量单位为mg/kg

2.3 脂肪酸组成

脂肪酸组成分析结果见图2。由图2可知，GLME中不饱和脂肪酸占(76.37±0.76)%，其中亚油酸(22.97±0.21)%和油酸(51.31±0.50)%含量较高。饱和脂肪酸中棕榈酸的含量最高(14.68±1.36)%。此外必需脂肪酸占(24.04±0.23)%。目前研究认为饱和脂肪酸食用过多易引起心血管疾病，本研究发现GLME超过10%的脂肪酸即主要脂肪酸为棕榈酸(C16：0)、油酸(C18：1)及亚油酸(C18：2)，不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比值大于3.2，表明GLME富含不饱和脂肪酸，具有调节血脂代谢、预防动脉硬化、抗血栓及抗癌等作用[22]。

*代表不饱和脂肪酸；#代表必需脂肪酸

2.4 氨基酸组成

在GLME中检测出的17种氨基酸中有7种属于必需氨基酸，结果见图3。其中水解氨基酸中亮氨酸含量最多(0.48±0.00)%，游离氨基酸中，必需氨基酸的含量基本一致。此外，水解氨基酸和游离氨基酸中必需氨基酸占总氨基酸的百分比分别为31.97%，28.00%。

*代表必需氨基酸

2.5 核苷类物质

核苷是核酸的主要组分，具有显著的生理功能，如5-氟尿嘧啶脱氧核苷能抗肿瘤等。图4为灵芝发酵菌丝提取物中的核苷类物质。由图4可知，在GLME中检测到了胞苷(0.71±0.07)×10-2mg/g、鸟苷(0.25±0.02)×10-2mg/g、腺苷(1.55±0.28)×10-2mg/g、尿苷(6.77±0.84)×10-2mg/g和尿嘧啶(0.34±0.03)×10-2mg/g。

图4 GLME核苷类物质HPLC结果

2.6 多糖

灵芝多糖被公认为灵芝中的主要活性成分之一，主要以杂多糖形式存在。据文献[23]报道，灵芝多糖多由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、L-岩藻糖等组成，具有抗氧化的作用[1]，还能提高机体抗肿瘤免疫功能[24]。经检测，GLME的粗多糖含量为5.74%(峰值分子量Mp为15 486，重均分子量Mw为41 559，数均分子量Mn为4 163)，高效液相色谱分析结果见图5。将GLME的粗多糖在波数4 000～400 cm-1内进行红外光谱扫描，如图6显示，分别在854 cm-1和890 cm-1处出现α-糖苷键和β-糖苷键的特征吸收峰，与文献[25-26]的结果相似，表明GLME的粗多糖含有α和β两种糖苷键。。此外，GLME粗多糖的主要单糖组分为甘露糖(0.33%)、葡萄糖(74.65%)和半乳糖(14.77%)。从含量上看，葡萄糖含量最高，在所有单糖组成比例达到80%以上，与之前文献[8]报道一致。半乳糖含量较多的多糖可以显著增加免疫活性，故半乳糖是灵芝多糖的重要指标成分。

图5 GLME粗多糖HPLC结果

图6 GLME粗多糖IR结果

2.7 急性毒性

灌胃一次GLME(50、500、2 000和5 000 mg/kg)后，小鼠在实验期内无死亡率，其体质量(图7)、器官质量(表1)、血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性与对照组相比无统计学差异(图8)。由此可知，该GLME在小鼠体内无明显急性毒性。

图7 GLME一次灌胃给药后14 d内小鼠体质量的连续变化

表1 GLME一次灌胃给药14 d后小鼠的体质量及器官质量变化(mean±SD)

图8 GLME一次灌胃给药14 d后对小鼠ALT、AST的影响

3 结论

为进一步开发GLME，评估其使用安全性，为功能性食品开发提供实验依据，笔者进行了为期14 d的小鼠经口急性毒性实验，从表观实验结果来看，实验期内小鼠的饮水、饮食、体质量与正常组相比没有统计学差异，未出现明显的中毒反应和死亡现象；从解剖结果来看，未观察到脏器组织出现明显的异常变化。此外，不同剂量下小鼠血清AST和ALT的活性与对照组也无统计学差异。因此GLME对受试个体没有明显急性毒性。综上所述，GLME可作为一种优质的营养品或药品在食品、医药工业等领域进一步应用开发。