基于功率谱密度频谱分析的小鼠睡眠分期方法的研究

首都医科大学中心实验室 （北京 100069）

内容提要： 目的：建立一种基于功率谱密度频谱分析的小鼠睡眠分期方法。方法：通过慢性埋置电极，利用在体多通道电生理记录系统同时采集小鼠大脑皮层脑电和颈部肌电的电生理信号，利用数据分析软件对原始电生理信号进行降噪处理和建立功率谱密度频谱图，然后结合小鼠睡眠的生理特点和行为视频，从功率谱密度频谱图上判别小鼠各睡眠期的时间间隔。结果：与人工目测分析电信号波形的睡眠分期结果相比，基于功率谱密度频谱分析的小鼠睡眠分期结果的符合率达91%以上。分析小鼠连续3d相同时间段的睡眠时间，发现变化较小。结论：本研究所建立的小鼠睡眠分期方法具有可信、稳定和简单的优点，运用该方法可评估小鼠的睡眠质量，为睡眠疾病诊断提供理论依据。

睡眠对人体健康至关重要。随着现代生活节奏的加快及生活方式的改变，不规律的生活和心里压力等因素常常导致睡眠障碍[1]。另外许多心血管疾病及精神疾病也与睡眠障碍密切相关[2]。总之，各种睡眠障碍性疾病日益成为一个突出的医疗及公共卫生问题，也逐渐被认识进而引起人们的关注。睡眠障碍的识别在很大程度上依赖于对睡眠过程的准确划分，即睡眠分期。从行为学和脑电生理学的指标来看，睡眠过程被分为快速眼动期、非快速眼动期，和清醒期；根据睡眠的不同深度，非快速眼动期期又分为N1、N2和N3期[3]。睡眠分期是研究睡眠及其相关疾病的重要手段，为睡眠质量评估提供了诊断和分析的理论性依据。不同的睡眠期对应着不同脑状态，于是人们正在探索设计一个准确可靠的算法来区分各睡眠期。

本文旨在进行一种基于功率谱密度频谱分析的睡眠分期方法的研究。主要工作为利用在体多通道电生理记录系统采集小鼠大脑皮层脑电（Electroencephalogram，EEG）和颈肌电（Electromyogram，EMG），利用系统自配的数据分析软件对EEG和EMG进行噪音去除和功率谱密度频谱分析，结合小鼠睡眠的电生理特征和行为建立一种简单、便利的小鼠睡眠分期方法。

1.资料与方法

1.1 一般资料

实验动物：选取清洁级的健康成年C57BL/6雄性小鼠6只，由首都医科大学实验动物部提供，许可证号：SCXK（京）2016-0008。实验动物的使用遵循首都医科大学实验动物管理细则。实验时间：2019年8月～2020年2月。

仪器设备：在体多通道记录系统（美国Plexon公司，型号OPX-D2-128），气体麻醉机（中国众实科技，型号ZSMV-1）。

电极：在2×2排针上焊接3根银丝（直径100μm）自制而成。

1.2 方法

1.2.1 动物手术

小鼠通过面罩输送异氟烷气体麻醉后（诱导率为2.0%，维持率为1.0%），将其头部固定在立体定位仪上，切开颅骨表皮并清理干净。在颅骨表面的运动皮层区（前囟前1.5mm，旁开±1.5mm），和小脑区各固定1个不锈钢螺旋螺钉。

集成电极的3根银丝，其中1根缠绕在固定在运动皮层区的螺钉上用来记录EEG，1根系在小鼠颈内肌肉上用来记录EMG，1根缠绕在固定在小脑区的螺钉上作为地线/参考电极；最后用牙科水泥把集成电极的银丝隔离并固定在颅骨上。术后恢复2周，即可用于实验记录。

1.2.2 数据记录

图1. EEG和EMG在噪音去除前后的比较

图2. 在各睡眠时相的EEG和EMG波形示例

图3. EEG和EMG的功率谱密度频谱图示例

实验时把动物移到记录室，并放在外围包有铜网的睡眠箱内（30cm×44cm），睡眠箱上方固定着一个低电阻导电滑环，导电滑环一端的接口连接到固定在动物头部的集成电极接口上，另一端连接到在体多通道电生理记录仪上。记录室维持室温（22±2）°C，自然明暗周期（12h/12h），在第2天灯亮时开始记录。

数据采集程序为Plexon®-OmniPlex®D，前置放大器采集的模拟信号（频率：0～5000Hz，采样率40kHz）实时转换为数字信号，然后用Bessel低通滤波器（60Hz）滤波，采样率降到1kHz。同时用红外摄像机记录动物的活动，采样率为25帧/s。采集的电生理信号和动物行为视频自动同步化并保存到计算机内。

1.2.3 数据分析

用数据分析软件NeuroExplor5的软件包：①连续信号的数字滤波器，对数字信号进行4阶的带通（0.3～30Hz）IIR巴特沃斯、4dB波纹椭圆切比雪夫和50dB阻带衰减滤波，目的是去除噪音、抑制基线漂移。图1为小鼠清醒期的EEG和EMG噪音去除前后的示例图。②波形复原程序，可在计算机屏幕上显示各通道的波形，图2为小鼠在3个睡眠期EEG和EMG的波形示例图。③频谱程序，EEG和EMG信号经过短时傅里叶变换，其中时间单元10s（时间分辨率10s），频数2048（频率分辨率0.25Hz），功率谱密度归一化，多维度（带宽3，维度5），得到信号的功率谱密度频谱图（图3）。结合动物自由活动视频、电信号波形图以及小鼠睡眠生理特征，可从功率谱密度频谱图上人为识别出小鼠各睡眠期的时间间隔。

根据记录的小鼠脑电波特征、肌电波特征和拍摄的小鼠活动视频，在功率谱密度频谱图则表现为，脑电波的功率谱密度值在小鼠清醒期集中在0.5～9Hz；在非快速眼动期集中在0.5～15Hz，其值比清醒期和快速眼动期高；在快速眼动期集中在5～10Hz，0.5～5Hz和10～15Hz的几乎没有。而肌电图功率谱密度值在5～15Hz，清醒期比非快速眼动期期和快速眼动期要高很多。根据以上特点，从功率谱密度频谱图上可人为直接识别出3个睡眠期的时间间隔（图3）。

表1. 功率谱密度频谱图的睡眠分期结果的符合率(±s,%)

表1. 功率谱密度频谱图的睡眠分期结果的符合率(±s,%)

相似度 清醒期 非快速眼动期 快速眼动期95.83±3.67 91.67±6.43 93.21±5.16

表2. 在不同日期内正常小鼠各睡眠期的时间占比的比较(±s,%)

表2. 在不同日期内正常小鼠各睡眠期的时间占比的比较(±s,%)

images/BZ_40_1287_3021_2303_3074.png清醒期(%) 非快速眼动期(%) 快速眼动期(%)第1天 28.89±4.76 63.52±10.15 7.59±0.89第3天 34.35±4.25 57.22±7.86 8.43±1.96

2.结果

2.1 睡眠分期的准确性检验

选实验用小鼠（3只），每只随机选取4h睡眠（10:00～12:00，22:00～24:00），并从中随机抽取4段，每段5min，共计1200s。将睡眠期的基于EEG和EMG波形的人工目测分析与基于功率谱密度频谱图人工分析得到结果进行比较，各睡眠期的符合率见表1（符合率=功率谱密度频谱图分析秒数/人工分析秒数×100%）。

2.2 功率谱密度频谱图在睡眠分期分析中的稳定性检验

小鼠各睡眠期在每日的相同时间相对稳定，功率谱密度频谱图分析睡眠分期结果应该较好地反映出这种稳定性，才能保证自身对照有意义。故分析了小鼠第1天至第3天10:00～16:00的3个睡眠期的时间分布情况，结果见表2。从表上可以看出，小鼠不同日子同一时间段内各睡眠期的时间比例相差不大（标准差均较小，或P＜0.05），故可认为此睡眠分期的分析方法进行小鼠睡眠研究是比较稳定的。

3.讨论

利用本实验室的在体多通道电生理记录系统和系统配套的数据分析软件，记录和分析小鼠睡眠过程的脑电和颈肌电的电生理信号，建立的基于功率谱密度频谱分析的小鼠睡眠分期方法，具有可信、稳定和简单的优点，运用该方法可评估小鼠的睡眠质量，为睡眠疾病诊断提供理论依据。

研究睡眠分期，对疾病的检测、预防和治疗有重要的临床意义。临床上通常用多导睡眠仪记录患者整晚的电生理信号如脑电、肌电、眼电、和心电等，通过对电信号的判别来进行睡眠分期。基于电生理信号的睡眠分期，早期的临床睡眠分析主要是人工目测分析，这种方法效率低且存在人为主观性误判的缺点[5]。

随着数字信号处理技术的发展，人们开始探索以计算机辅助的自动睡眠分期方法，目前已取得一定成果的方法主要可分为两类。一类是通过提取电生理信号的线性动力学特征参数（如幅值、均值、峭度、功率等）和阈值比较的方法来进行自动睡眠分期，如以脑电图为主的时域分析和频域分析，这些方法不能同时兼顾时间和频率的分辨率，且还需随时调整阈值[5,6]。另一类是通过提取电生理信号的非线性动力学特征（离散度、相关维数、复杂度等）和分类的方法来建立自动睡眠分期模型，如人工神经网络分析、聚类分析、线性判断分析等[7,8]。这些方法往往需要大量的数据才能建立可靠的模型，且更适用于一些大型数据集，以解决遗传学、流行病学或精密医学方面的问题[9]。总之，目前还没有公认的可用于人类或动物的自动睡眠分期的金标准。

本文建立的基于功率谱密度频谱分析小鼠睡眠的分期方法是利用系统自配的数据分析软件对EEG和EMG进行短时傅里叶变换后创建功率谱密度频谱图。短时傅里叶变换的基本思想是：把信号划分成许多小的时间间隔，用傅里叶变换分析每一个时间间隔内的频率[10]。这样即可弥补时域分析时忽略频率分辨率、而频域分析时又忽略时间分辨率的缺点。由于是对每一只动物建立自己的功率谱密度频谱图，这样就避免了因动物个体差异导致睡眠特征变化而带来的睡眠分期结果的误差。