CYP450表氧化酶/EET代谢途径通过HIF-1α减轻肥胖小鼠脂肪炎症*

焉晓乘， 牟维娜， 强 晔， 赵蕙琛， 孙 琦，2， 姚晓敏，3， 张玉超， 刘元涛△

（1青岛大学医学院附属青岛市市立医院内分泌科，山东青岛266011；2青岛市胶州中心医院内分泌科，山东青岛266300；3日照市人民医院内分泌科，山东日照276826）

目前糖尿病及肥胖呈全球流行趋势。肥胖与糖尿病密切相关，其病理生理机制尚不清楚，因此，脂肪组织生物学的研究引起广泛关注。研究证实脂肪组织不仅是惰性的脂肪储存库，还是重要的内分泌器官［1］，可通过自分泌及旁分泌的方式释放多种细胞因子［2］，参与局部和系统的代谢及炎症过程，调节外周组织对胰岛素的敏感性，参与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的发生发展［3］。同时，脂肪细胞过度膨胀，导致脂肪组织内出现缺氧微环境，诱导脂肪细胞与巨噬细胞表达促炎症因子、巨噬细胞浸润、脂肪细胞坏死等，进一步加重脂肪组织的炎症程度。

环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）为花生四烯酸（arachidonic acid，AA）经细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）表氧化酶催化生成的代谢产物［4-5］，其中 11，12-EET 和 14，15-EET是多数细胞和血管中EETs的主要存在形式，具广泛的生物效应，如抗炎及促进血管再生［6-7］。我们的前期研究证实，糖尿病小鼠组织中CYP450表氧化酶CYP2J2表达显著降低，EETs可显著促进糖尿病小鼠血管再生，抑制组织炎症反应［8］。还有研究提示EETs在肥胖和IR等方面发挥重要作用［9］。CYP2J2/EET途径在IR中的作用日益受到关注［10］，但是相关机制目前国内研究较少。根据已有研究，我们推测CYP450/EET代谢通路可能通过促进血管生成作用减轻肥胖诱导的慢性炎症及IR，并通过设计动物实验进行验证。

材料和方法

1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6Cnc小鼠40只，3周龄，体重（19±1）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006。每笼5只饲养在SPF级动物房中，每日光照12 h。自由饮食饮水。

2 主要试剂

11，12-EET 和 14，15-环氧二十碳-5（Z）-烯酸［epoxyeicosa-5（Z）-enoic acid，EEZE］购于 Cayman；兔抗 CD31（1∶300）购于 Abcam；兔抗 CYP2J2（1∶1 000）、鼠抗GAPDH（1∶5 000）及小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 ELISA试剂盒购于Proteintech；鼠抗低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α；1∶500）购于EMD Millipore；Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×）购于 Cell Signaling Technology；小鼠胰岛素高敏ELISA试剂盒购于Arigo Biolaboratories。

3 主要方法

3.1 肥胖模型构建及分组 将小鼠分为普通饲料组和高脂饲料组，分别喂饲普通饲料和高脂饲料（脂肪提供热量的40%）。每7 d测定小鼠体重，当高脂饲料组小鼠体重超过普通饲料组小鼠30%，确定为肥胖小鼠成功建模。将肥胖小鼠又随机分为：肥胖（obesity，OB）组（生理盐水腹腔注射，n=10）、EET组（0.1 g·kg-1·d-111，12-EET 腹 腔 注 射 ，n=10）［11］和EEZE组（0.1 g·kg-1·d-114，15-EEZE腹腔注射，n=10）［12］。普通饲料组小鼠腹腔注射等量生理盐水作为正常对照（normal control，NC）组（n=10）。干预第7天禁食8 h后于眼眶静脉丛取血，静置30 min后分离血清。最后处死小鼠，取附睾和肾周脂肪置于4%组织细胞固定液固定或液氮内保存。

3.2 ELISA实验测定小鼠血清炎症因子水平 参照ELISA试剂盒说明书，按顺序加入小鼠血清和试剂盒试剂孵育，洗板后加入检测抗体孵育1 h，加入链霉素亲和的辣根过氧化物酶抗体孵育，最后加显色底物。加入终止溶液终止反应后立即使用酶标仪读取波长450 nm的吸光度（A）。用ELISA Calc软件拟合出标准曲线，以标准品的A值为纵坐标，浓度为横坐标。回归分析求出最好的拟合曲线，浓度和A值取对数拟合。依照拟合的回归曲线来求出小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

3.3 胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）的测定 根据ELISA试剂盒说明书对血清样品进行处理，计算小鼠血清胰岛素水平。HOMA-IR=空腹血糖水平（mmol/L）×空腹胰岛素水平（mU/L）/22.5。

3.4 Western blot实验 用预冷的RIPA裂解液提取附睾脂肪组织蛋白。应用10%SDS-PEAG后，转模1.5 h，室温脱脂牛奶封闭1 h，4℃I抗孵育过夜，室温II抗孵育1 h，充分洗膜后ECL显像。ImageJ 1.42定量分析结果。

3.5 免疫组化分析 脂肪组织经脱水、石蜡包埋、切片（组织厚度为5µm）、脱蜡和水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭后，加入I抗4℃孵育过夜，室温II抗孵育50 min，DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水封片，显微镜镜检拍照并扫描图片，DAB标记阳性结果显示棕黄色。用QuantCenter 2.1软件（3DHISTECH）分析抗体阳性表达程度，使用组织化学评分（histochemistry score，H-SCORE）对组织染色进行半定量分析。组织学评分方法：将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值。H-SCORE=（percentage of cells of weak intensity×1）+（percentage of cells of moderate intensity × 2）+（percentage of cells of strong intensity× 3）。

3.6 RT-qPCR检测脂肪组织HIF-1α的mRNA水平 取10 mg附睾脂肪组织，严格按照试剂盒说明书进行操作提取总RNA，测定浓度后反转录为cDNA，加入扩增反应体系运用RT-qPCR法扩增，40个循环结束后采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，检测目的基因的mRNA相对表达水平。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR相关引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4 统计学处理

采用SPSS 1.0.0.1246软件统计分析，各测定值以均数±标准差（mean±SD）表示，各组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 EET可以降低肥胖小鼠胰岛素抵抗水平

与NC组相比，OB组HOMA-IR显著升高（P＜0.05）；与OB组相比，EET组HOMA-IR显著降低（P＜0.01），EEZE组HOMA-IR无显著差异；EEZE组HOMA-IR显著高于EET组（P＜0.01），见图1。

Figure 1.Treatment with EET attenuated insulin resistance in obese mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.图1 EET可以降低肥胖小鼠胰岛素抵抗水平

2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表达水平显著降低

Western blot结果显示，OB、EET和EEZE组小鼠附睾脂肪组织CYP2J2蛋白表达水平均较NC组显著降低（P＜0.01），其余组间两两比较差异无统计学意义，见图2。

Figure 2 The protein expression levels of CYP2J2 in epididymal adipose tissues of obese mice were significantly reduced compared with normal C57BL/6JCnc mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group.图2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表达水平显著降低

3 EET可以减轻肥胖小鼠脂肪组织缺氧程度

为评估各组小鼠组织缺氧程度，我们检测了小鼠附睾脂肪组织中HIF-1α蛋白的水平。与NC组相比，OB组HIF-1α表达水平显著升高（P＜0.01）；与OB组相比，EET组HIF-1α蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与EET组相比，EEZE组HIF-1α蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），见图3A。但4组小鼠附睾脂肪组织HIF-1α mRNA水平无显著差异，见图3B。

Figure 3.Treatment with EET attenuated the anoxic conditions in epididymal adipose tissues of obese mice.A：Western blot for determining the protein level of HIF-1α；B：real-time PCR for determining the mRNA level of HIF-1α.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.图3 EET可以减轻肥胖小鼠脂肪组织缺氧程度

4 EET可降低肥胖小鼠体内炎症因子水平

检测小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β水平，结果显示，OB组小鼠血清炎症因子水平显著高于NC组（P＜0.05）；EET干预7 d后，小鼠血清中4种炎症因子水平与OB组相比显著下降（P＜0.05），见图4。

Figure 4.Administration of exogenous EET resulted in reduced production of inflammatory cytokines in the serum of obese mice.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.图4 EET可以降低肥胖小鼠体内炎症因子水平

5 EET可以促进肥胖小鼠脂肪组织血管生成

使用CD31标记附睾脂肪组织中血管样组织以检测EET干预后小鼠附睾脂肪组织的血管生成情况。CD31染色如图5箭头所示，与NC组比较，OB组CD31蛋白量减少，EET组CD31染色水平接近NC组。图像统计分析结果显示，在药物干预第7天，与NC组相比，OB组小鼠的H-SCORE显著降低（P＜0.05），EET组H-SCORE值与NC组持平；与OB组相比，EET组H-SCORE显著升高（P＜0.05）。

Figure 5.EET promoted angiogenesis in epididymal adipose tissues of obese mice.At day 7 after drug treatment，vessel-like structures（CD31-positive）in epididymal adipose tissues were observed by immunohistochemistry（left：scale bar=500 µm；right：scale bar=50 µm），and histochemistry score（H-SCORE）of CD31 was calculated.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.图5 EET可以促进肥胖小鼠脂肪组织血管生成

讨 论

既往研究表明CYP450/EET途径对胰腺细胞功能及外周组织对胰岛素的敏感性有重要影响。5，6-EET可刺激大鼠离体胰岛分泌胰岛素，过表达CYP2J2或可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）抑制剂可显著减轻小鼠外周IR及代谢功能障碍［13-15］。临床研究显示，2型糖尿病患者循环EET代谢产物的血浆浓度是降低的［16］；大鼠实验研究显示，高脂饮食诱导肥胖大鼠肾脏CYP450表达降低［17］，提示CYP450/EET途径障碍可能与糖尿病的发生及进展有关。肥胖（尤其是向心性肥胖）是糖尿病发生的重要危险因素之一。目前研究认为肥胖状态下，脂肪炎症可能是导致IR的重要原因，但具体机制尚不明确。本研究旨在探索CYP450/EET通路与肥胖诱导的脂肪炎症及IR的关系并探讨其机制。

大量证据表明，炎症是IR的重要原因。炎症因子通过核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）系统，抑制胰岛素的磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）通路，干扰胰岛素信号转导，导致IR［18］。巨噬细胞和白细胞代谢生成的细胞因子（如TNF-α等）可激活内皮细胞，促进细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）的表达，而CAMs是一类位于细胞膜表面的糖蛋白，是炎症的诱导剂［19］。有研究报道，11，12-EET是对血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表达最强的抑制剂［20］。NF-κB是一种广泛存在于各种细胞中的转录因子，因其能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合而得名。激活的NF-κB可促进许多致炎因子的转录和表达，被作为炎症治疗的“靶点”。另有研究表明，sEH抑制剂可抑制NF-κB活性，减少炎症细胞浸润［21］。注射外源性EETs可抑制NF-κB的活化和转位，从而显著抑制TNF-α诱导的小鼠颈动脉内皮细胞VCAM-1的表达，减少单核细胞对内皮细胞的黏附［20］。缺氧条件下，CYP2J3/EETs可能通过抑制caspase-3蛋白表达及活性调节心肌细胞活力［22］，而11，12-EET可激活肝脏细胞与动脉内皮细胞内缺氧反应元件的启动子活性，诱导HIF-1α稳定表达。可见，CYP450/EET通路与缺氧导致炎症反应有关［23］。

为探讨CYP450/EET代谢通路与肥胖诱导的脂肪组织炎症的关系，我们首先检测了CYP450表氧化酶在肥胖小鼠脂肪组织中的表达，其中CYP2J2蛋白表达水平显著降低。为明确CYP2J2下调与脂肪炎症的相关性，我们观察了外源性EET对脂肪炎症的影响，结果显示肥胖小鼠脂肪组织中炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-β表达显著增多，外源性11，12-EET治疗可以显著降低脂肪组织中炎症因子的表达水平，而EET拮抗剂14，15-EEZE则导致各种炎症因子显著增加。以上结果提示CYP450表氧化酶表达减少可能是肥胖状态下脂肪炎症的重要因素之一。

缺氧是导致炎症的重要因素之一。本研究观察到，与正常小鼠相比，肥胖小鼠附睾脂肪组织中HIF-1α蛋白表达水平升高，提示肥胖诱导的脂肪炎症可能与缺氧有关。为探讨CYP450/EET对炎症的影响机制，我们观察了外源性EET对血管形成及缺氧的影响。结果显示，EET干预的肥胖小鼠脂肪组织中CD31阳性率显著增增加，而HIF-1α蛋白表达显著下降。上述结果提示，EET可通过促进脂肪组织血管生成，缓解缺氧，从而抑制组织炎症。

综上所述，本研究提示CYP450表氧化酶低表达可能是肥胖诱导IR的重要原因，外源性EET可显著减轻肥胖导致的IR，其作用机制可能与促进血管生成、缓解缺氧、减轻炎症有关。