酚类抗氧化剂及其代谢产物对鱼类的毒性研究进展

石子悦，刘旺，黄莹，刘阳，梁雪芳

(内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010021)

0 前言

抗氧化剂的品种经由简单到复杂、低效到高效的发展，目前市场上的合成类抗氧化剂以受阻酚类和芳胺类最为常见[1]，其中受阻酚类因具有良好的抗氧化效果以及较高的热稳定性被广泛使用[2]。受阻酚是一类在苯环的酚羟基一侧或两侧有取代基的化合物[3]，大多数合成酚类抗氧化剂(Synthesis of Phenolic Antioxidants, SPAs)都具有受阻酚的结构[4]。在与过氧自由基(ROO·)，烷氧自由基(RO·)，羟基自由基(·OH)等反应时，SPAs的酚羟基为氢供体，更易与自由基结合生成相对稳定的化合物，阻止进一步氧化反应(图1)[3,5]。同时，SPAs在给出氢原子后生成寿命较长的酚氧自由基ArO·，由于酚氧自由基与苯环处于共扼体系中，因而比较稳定，活性较低，同时又具有再捕获自由基的能力，可进一步终止链反应[5]。

SPAs按化学结构大体可分为3种：单酚类[如2,6-ditert-butyl-4-methylphenol (BHT)、2-tertbutyl-4-methoxyphenol (BHA)、2,4-di-tert-butylphenol (2,4-DTBP)、tert-butyl hydroquinone (TBHQ)等]、双酚类[如2,2’-methylenebis(6-tert-butyl-4-methylphenol) (AO2246)、2,2’-ethylidenebis(4,6-di-tert-butylphenol) (AO22E46)等]和多酚类[如1,1,3-tris(2-methyl-4-hydroxy-5-tert-butylphenyl)butane (AO-CA)]。单酚类抗氧剂相对分子质量较低，易从聚合物中迁移出来进入环境。双酚类和多酚类抗氧剂的相对分子质量较大，在聚合物中迁移率较低，热稳定性较高，在环境介质中的检出率相对较低[2]。

图1 受阻酚类抗氧化剂结构式及抗氧化机理[4-5]

1 水环境中的SPAs及其代谢产物

SPAs因其成本低、易获取、具有高抗氧化能力,能够防止产品被氧化或变质而被广泛应用于日常生活中[6]。目前，由于其大量生产、使用和随意处置，在水环境中已被频繁检测到(表1)。水环境中的SPAs主要由工业废水和市政污水输入，而用于添加剂、包装材料、化妆品和个人护理品、以及药品、橡胶等中的SPAs在物品磨损和破碎过程中极易释放出来，最后通过污水处理厂处置或者直接排出，进入到水环境中。例如，在中国33个城市的污泥样品中检测到了质量比为183 ng/g～41 μg/g(平均值4.96 μg/g)的SPAs及其代谢产物[7]。同时，这些物质又通过挥发、降水、地表径流和下渗等作用进入到河流、湖泊和地下水等淡水系统中(表1)。另外，一些挥发到空气中或附着于灰尘上的SPAs[8]可通过湿沉降的方式直接进入水环境中。然而，SPAs在水环境中并非单独稳定的存在，往往与其代谢产物共存。如BHT在水环境中易通过氧化或光解生成毒性更高的代谢产物[9-10]。

Wang等[11]发现虽然污水处理厂对BHT的去除率可达90%，而出水中其代谢物含量却大大增加(去除率：-3 020%～-65.6%)，表明BHT形成的代谢物无法在处理过程中有效去除并最终进入水环境。Wang等[12]表明，从2006—2016年，在中国渤海地区采集的软体动物体内，BHT的富集质量比为383～501 000 ng/g，其4种代谢产物2,6-ditert-butylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(BHT-Q),2,6-ditert-butylbenzene-1,4-diol(BHT-OH),3,5-ditert-butyl-4-hydroxybenzaldehyde(BHT-CHO)和3,5-ditert-butyl-4-hydroxybenzoic acid (BHT-COOH)的总富集质量比可达31.6～11 500 ng/g。上述研究表明，SPAs及其代谢物均可能通过生物富集和食物链的传递对水生生物和人体产生潜在的毒性效应。

表1 SPAs及其代谢产物在水环境中的质量浓度①

续表

2 SPAs对鱼类的毒性效应及其机制

2.1 急性毒性效应

近年来，关于SPAs在毒性方面的研究大多针对大鼠、小鼠等哺乳动物[18-20]，关于SPAs对鱼类的急性毒性数据较为有限。Yang等[21]将斑马鱼胚胎暴露于4种SPAs 4 h后，依据96 h半致死浓度(lethal concentration 50%,LC50)数值，其毒性大小为：AO2246(5.2 μmol/L)>TBHQ (55.4 μmol/L)>BHA (99.7 μmol/L)>BHT (>200 μmol/L)，表明双酚类的毒性高于单酚类。Liang等[22]用BHT对6～8 h的斑马鱼胚胎进行暴露，测得BHT的ρ(96 h LC50)为57.61 μmol/L (<200 μmol/L)，其急性毒性数据和上述报道不一致，可能与暴露实验的条件(如鱼龄、温度、换水频率等)不同有关。另外，Wang等[23]通过ECOSAR软件预测BHT对鱼类的ρ(96 h LC50)为0.25 mg/L(=1.13 μmol/L)，明显低于已报道的实验数据。因此，对于SPAs对鱼类的急性毒性仍存在争议。

2.2 发育毒性效应及机制

鱼类早期生命阶段对环境污染物的敏感度更高，这个阶段的毒性效应可能会一直持续到生命后期，甚至导致个体死亡等结果[12]。

2.2.1 SPAs对孵化率和行为的影响

孵化是斑马鱼早期发育的一个重要过程，揭示胚胎向幼虫的转化，因而孵化率被广泛用于化学影响评价[24]，不同的SPAs对斑马鱼胚胎的孵化率影响不同，如Yang等[21]将斑马鱼胚胎在20 μmol/L的BHA, TBHQ和AO2246中暴露72 h后，孵化率均显著下降,分别为15%, 76.7% 和78.3%。另有研究表明[25]，1 mg/L BHA与2 mg/L微塑料(microplastics, MPs)混合暴露72 h后，其对斑马鱼仔鱼孵化率的影响明显大于BHA单独暴露组，原因可能是BHA作为塑料添加剂，通过非共价键或范德华力与塑料等聚合物混合后，在塑料破碎过程中释放到环境中，由MPs作为载体将其转移到生物体中并促进其生物积累性和毒性。

行为反应也可作为鱼早期生命阶段的毒性敏感指标，常见的行为包括自发运动、躲避捕食者、游泳行为等[26]。根据趋光性可以判别斑马鱼行为的变化，通常情况下，成年斑马鱼表现出避光行为，仔鱼则更喜欢光照环境[27]。Liang等[22]研究发现，斑马鱼仔鱼暴露于0.01 μmol/L BHT 6 d后，其运动行为(移动距离和速度)虽未发生变化，但在黑暗中的停留时间却增加，表现出避光行为，说明低浓度的BHT暴露影响了仔鱼的趋光行为。而1 μmol/L BHT组中仔鱼的移动距离和速度显著增加，同时进入黑暗区域的频率增加，说明高浓度BHT对仔鱼的游动和趋光行为均产生了影响。进一步研究发现，0.01 μmol/L BHT暴露组中，datmRNA基因的表达显著上调，而1 μmol/L浓度组drd3 mRNA水平显著下降，表明不同浓度的BHT可能通过不同机制影响仔鱼多巴胺(多巴胺是一种神经递质，能够调控中枢神经系统的多种生理功能[28])水平，从而造成斑马鱼趋光行为的差异。

2.2.2 SPAs对心脏发育的影响

心脏是斑马鱼生长过程中首先形成并发挥作用的主要器官，心率是反映心脏功能的重要指标[29]，而暴露于SPAs下的斑马鱼心率会受到影响，且可能影响其心脏的发育和功能。有研究表明，将斑马鱼胚胎在20 μmol/L BHA,20 μmol/L TBHQ, 200 μmol/L BHT和2 μmol/L AO2246中暴露120 h后，心率会显著降低，影响胚胎心脏的正常发育，引起心脏功能的紊乱[21]。另一项研究中也有类似的发现，即：斑马鱼胚胎暴露于0.1～60 μmol/L BHT 48 h和72 h后，心率显著降低了25%～30%，而这可能引起心血管发育缺陷[22]。有学者认为，在胚胎发育期间，外源性化学物质诱导心脏发育的改变可能会引起鱼类呼吸作用的改变[30]，而线粒体功能障碍又会影响斑马鱼的发育和心血管功能[31]。研究发现，BHA确实会通过与线粒体相互作用，引发其渗透性功能的转变，导致细胞色素C的释放，诱导细胞凋亡[32]。而Vandghanooni等[33]则认为BHA导致的细胞凋亡是通过染色质和DNA的断裂所引起的。

2.2.3 SPAs的致畸作用

SPAs可引起鱼类发育过程中色素异常、心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲、鱼鳔发育异常等致畸作用。研究显示[21-22]BHT暴露浓度>15 μmol/L时，即可观察到96 h的斑马鱼仔鱼发生心包水肿，暴露于200 μmol/L BHT下120 h时，斑马鱼仔鱼发生了严重的脊柱弯曲。不仅如此，SPAs引发鱼类畸形可能是通过影响相关基因的表达或甲状腺激素的分泌。如，Hahn等[34]将斑马鱼仔鱼在10 μmol/L TBHQ中暴露120 h时，其视网膜等部位的色素沉积异常，同时发现TBHQ会显著抑制mitfa基因的表达，此基因用于调控黑色素细胞的分化以及黑色素合成酶的表达[35]，认为仔鱼色素异常可能与TBHQ抑制mitfa基因的正常表达有关。Yang等[21]通过实验发现，BHA可通过诱导甲状腺激素分泌紊乱，在体内失衡，使斑马鱼仔鱼鱼鳔发育不完整，具体表现为BHA逐渐下调crhmRNA的表达，在20 μmol/L(暴露最高浓度)时显著提高ugtlab基因的转录水平，而这些基因均与甲状腺激素的分泌有关。

2.3 内分泌干扰毒性效应及机制

近年来，人们越来越关注SPAs对生物的内分泌干扰效应，内分泌系统有助于调节生理过程，如消化、代谢、生长和发育，其几乎参与了维持体内平衡的所有阶段[36]。其中，许多外源性化合物通过与雌激素受体结合，产生类雌激素或抗雌激素作用，从而影响生物体的内分泌系统[37]。目前，在已知的酚类抗氧化剂中，明确提出具有雌激素效应的物质是非受阻酚类化合物，如双酚A (bisphenol A，BPA)[38]，而关于SPAs的雌激素效应尚存在争议。体外实验表明：BHA浓度≥10-5mol/L时，会刺激人雌激素受体ERβ (esteogen receptor β) 的转录活性和体外乳腺癌细胞的生长[39]，然而在荧光素酶检测报告中显示，T47D-Kbluc乳腺癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞分别暴露于0.3～100 μmol/L和0.3～200 μmol/L BHA时，BHA对2种细胞系均显示出强烈的抗雌激素活性，且与没食子酸丙酯(propyl gallate, PG)的结合更会增强这种抗性效果[40]。另外，Tollefsen等[41]通过虹鳟鱼肝脏细胞质制剂的竞争性结合研究发现，(Tert-butylphenols)TBPs具有抗雌激素活性。与此研究结果类似，Wang等[14]观察到TBPs与2.5×10-4μmol/L E2(estradiol)共同暴露时，人雌激素受体ERβ与ERɑ (esteogen receptor ɑ)受到抑制，表明TBPs具有抗雌激素活性。而Pop等[42]发现，将MDA-Kb2乳腺癌细胞暴露于0.3～300 μmol/L BHT、BHA时，2种化合物均未表现出雄激素活性，但与1 000 pmol/L 5-alpha-dihydrotestosterone (DHT)混合暴露，则会表现出抗雄性激素作用。

体内实验表明，SPAs并不会直接与雌激素受体结合，而是通过HPGL轴(hypothalamic-pituitary-gonadal-liver axis, HPGL-axis)作为渠道间接引起雌激素效应。Yang等[43]通过结合离体和活体实验证明了SPAs产生内分泌干扰效应的机制：4种SPAs(BHA、BHT、TBHQ、AO2246)并不会直接和斑马鱼的雌激素受体结合引起雌激素效应，而是通过影响StAR和3βHSD等基因的表达干扰性腺细胞中类固醇激素的生成，进而引起斑马鱼性腺中的E2和睾酮 (testosterone, T) 水平的变化，再通过调节HPGL轴产生内分泌干扰作用。化学物质对鱼类等水生生物的内分泌干扰作用可能对生殖腺组织结构造成损伤，并对生殖发育产生影响[44]。因此，SPAs导致的激素失衡，可能引发生殖毒性。虽然目前生殖毒性研究大多集中于小鼠等哺乳动物[45-46]，很少见报道表明，SPAs对鱼类等水生生物具有生殖和繁殖毒性，但已有研究显示该类化合物可产生内分泌干扰效应，其潜在的生态风险需要进一步研究。

3 SPAs代谢过程研究及产物毒性预测

由于SPAs的结构特性，在复杂多变的环境中会产生一系列的代谢产物。其中BHT，BHA，抗氧剂168 (Irganox168) 的部分代谢途径比较明确，而其他酚类抗氧化剂的代谢路径及最终产物尚在研究之中。

TBHQ除单独用作抗氧化剂外，亦是BHA通过在其对位添加一个羟基而降解形成的代谢产物[21]。而水环境中的BHT一方面通过光降解，将烷基取代基(叔丁基和对位甲基)氧化为BHT-OH和2,6-ditert-butyl-4-(hydroxymethyl)phenol (BHT-CH2OH)，再将BHT-CH2OH进一步氧化或通过水体中微生物氧化生成BHT-CHO，而BHT-COOH作为由烷基取代基氧化形成的主要的代谢物，可能通过相应的醇(BHT-OH)和醛(BHT-CHO)生成[10,23,47]；另一方面，BHT可通过芳香环π电子系统氧化生成BHT-Q[48]，见表2和图2。结构复杂或者分子质量较大的多酚类抗氧剂的降解产物多为单酚类物质。如抗氧剂1010/1076 (Irganox 1010/1076)可水解为3-(3,5-二叔丁基-4-羟苯基)丙酸 (Irganox 1310)，并可进一步降解为BHT-Q、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺(4,5)癸-6,9-二烯-2,8-二酮(AS-70063)[49]。Irganox 168可通过光解[50]及水解[49]降解为单酚类化合物2,4-DTBP，并进一步降解为结构更简单的(2-tert-butylphenol)2-TBP和(4-tert-butylphenol)4-TBP[51]。

表2 SPAs及典型代谢产物物理化学特性和毒性预测①

A—BHT叔丁基的氧化路径；B—BHT对位甲基的氧化路径；C—BHT芳香环的氧化路径。图2 BHT的生物转化和降解过程[11，23]

有限的毒理学研究表明，SPAs的代谢产物相对于母体化合物本身往往具有更高的毒性效应。TBHQ对斑马鱼胚胎96 h急性毒性高于BHA，而在亚致死水平上，TBHQ具有发育毒性[21]。早前对哺乳动物研究证明BHT代谢产物可能导致癌变或其他疾病，例如BHT-CHO，BHT-CH2OH和BHT-Q可能导致DNA裂解[52]以及核小体间断裂[53-54]，且BHT-Q在低浓度(10-6mol/L)下即可导致DNA裂解，但BHT在此浓度下对DNA结构并无影响。另外，作为多酚类化合物的主要代谢产物，TBPs对水生生物的毒性效应近年来逐渐受到关注。Wang等[14]利用发光菌P.phosphoreum及V.fischeri评价TBPs的毒性，结果显示,2-TBP对2种发光菌的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)分别为2.37和107.2 μmol/L,2,4-DTBP则为181.8和2 830 μmol/L，表明2-TBP毒性高于2,4-DTBP；另外，当莱茵衣藻C.reinhardtii分别暴露于1，5和10 mg/L下的2-TBP(48 h)和2,4-DTBP(72 h)后，莱茵衣藻的生长受到显著抑制。Cui等[55]同样利用发光菌P.phosphoreum证实2,6-DTBP的代谢物2,5-DTBP (2,5-ditert-butylphenol)[ρ(EC50) = 6.99 mg/L]的急性毒性明显高于其本身[ρ(EC50) =808.19 mg/L]。此外，4-TBP可以显著影响包含浮游藻类、轮虫、虾和水蚤的微生态群落的丰度[56]。

Wang等[23]针对鱼类，水蚤和绿藻3种不同的营养水平，借助ECOSAR软件预测了BHT及5种代谢产物的急性和慢性毒性。结果显示，除了BHT-Q[ρ(96 h LC50)=0.03 mg/L]之外，大多数代谢产物对鱼类急性毒性[ρ(LC50)=1～10 mg/L]均低于BHT[ρ(LC50)=0.25 mg/L]，整个转化过程大体向降低毒性的方向转变。慢性毒性(ChV)预测结果表明，虽然大部分代谢产物的毒性仍然低于BHT，但BHT-CHO[鱼ρ(ChV)=0.06 mg/L；水蚤ρ(ChV)=0.02 mg/L]及BHT-Q[鱼ρ(ChV)=0.01 mg/L；水蚤ρ(ChV)=0.06 mg/L]对鱼和水蚤的毒性表现为接近甚至略高于其母体化合物(鱼ρ(ChV)=0.03 mg/L；水蚤ρ(ChV)=0.08 mg/L)。为了全面比较不同类型SPAs及其代谢产物对鱼类的毒性，利用毒性预测软件(TEST, Toxicity Estimation Software Tool, V4.2.1; https://cfpub.epa.gov/si/si_public_record_Report.cfm?Lab=NRMRL&dirEntryId=243050)评估了几种典型单酚及多酚类化合物对黑头呆鱼(pimephales promelas,Alepocephalusaustralis)的毒性(表2)。结果显示BHT代谢产物的ρ(96 h LC50)(0.69～2.13 mg/L)普遍高于BHT (0.67 mg/L)，急性毒性较低，这与ECOSAR软件预测结果一致。同时发现，在TEST预测结果中，BHT-CH2OH、BHT-CHO和BHT-COOH均显示具有发育毒性，而BHT不具有发育毒性，该结果和ECOSAR的预测一致表明BHT的代谢产物可能具有更高的慢性毒性。然而，与ECOSAR预测结果[23]相反，TEST预测结果显示BHT-Q并未表现出强于BHT的毒性。与BHT类似，多酚类SPAs如Irganox 1010等对黑头呆鱼的急性毒性[ρ(96 h LC50)≤ 2.63 mg/L]高于其大部分的降解产物[ρ(96 h LC50)=1.31～35.32 mg/L]。同时，在预测的代谢产物中，除了2,6-DTBP，其他均表现出发育毒性。综上，尽管预测结果显示SPAs的急性毒性在代谢过程中降低，然而其代谢产物往往表现出更高的慢性毒性，同时SPAs及其代谢产物对不同物种的毒性效应存在差异，表明其代谢过程和毒性机制存在差异，需要进一步研究。

4 结语

近年来SPAs及其代谢产物在水环境中不断检出，研究表明SPAs对水生生物具有发育毒性及潜在的内分泌干扰效应，而且其代谢物可能比SPAs本身具有更强的毒性，该类污染物的生态效应和风险开始受到广泛关注。然而目前对于SPAs的研究仍处于起步阶段，与非受阻酚类抗氧化剂相比，受阻酚类SPAs及其代谢产物的环境行为，对水生生物的毒性效应研究覆盖面小，尤其是对高等水生生物的研究不足；而且毒性作用机制研究不够深入，特别是分子水平上的毒性数据和机理探讨匮乏。此外，关于酚类抗氧化剂代谢途径的研究主要存在以下两方面问题：一是代谢途径尚不明确，完整的代谢链尚未形成，部分过程停留在推测阶段；二是关于代谢产物的毒理学研究有限。

为准确实现对SPAs及其代谢物的化学品管理及生态风险评估，未来研究应聚焦于以下几个方面。(1)开展合成酚类抗氧化剂及其代谢物在水生生物体内的分布及浓度检测，为该类化合物的生物富集和生物转化研究提供更多的背景资料；(2)开展对SPAs潜在毒性分子机制的研究，并建立起分子水平上的毒理学效应与个体乃至种群水平上的不良后果之间的联系；(3)探究并完善SPAs的代谢机制，并对现已明确的代谢产物(如BHT-Q)开展毒性效应评价。