2种典型碳纳米管低浓度暴露诱发锦鲫组织损伤与肝脏氧化损伤效应研究

阚海峰，陆明霞，黄继涛，高士祥

(1.福建省特色生物化工材料重点实验室，绿色能源与环境催化福建省高校重点实验室，宁德师范学院化学与材料学院，福建 宁德 352100;2.污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京大学环境学院，江苏 南京 210023)

碳纳米管(CNTs)是一种人工合成的碳材料，于1991年被Ijima[1]发现，其碳结构十分奇特，为石墨片层围绕中心轴螺旋卷曲而产生的管状物[2]。Serag[3]等人利用TEM技术发现，多壁碳纳米管(MWCNTs)可以穿透植物原生质体的细胞膜进入到植物细胞内。文献[4]表明，石墨烯能在大型蚤的体内富集，且大型蚤体内富集的大量石墨烯能够从母代传递到子代，从而对下一代大型蚤的生长和群体行为产生危害。Smith[5]和Federici[6]的研究表明碳纳米材料能够影响鱼类的生理功能、损害鱼的器官组织，尤其是鱼鳃受到伤害最明显，同时造成鱼的生化指标紊乱。文献[5]显示，经质量浓度为0.1～0.5 mg/L的单壁碳纳米管暴露10 d，虹鳟鱼的各项生理功能受到显著影响，生化指标异常，病理切片出现明显症状，暴露时间增加还会出现肿瘤。

抗氧化防御系统是生物体受到外源污染物入侵时的敏感系统，可以作为污染物低剂量长期暴露的敏感生物指标，已有多位学者研究了碳纳米管、石墨烯和纳米二氧化钛对鱼和其他生物肝脏的损伤和抗氧化防御系统的影响[5-7]。现选取2种典型碳纳米管单壁碳纳米管(SWCNT)和羟基多壁碳纳米管(MWCNT-OH)进行低浓度亚急性半静态暴露，研究低浓度亚急性暴露下2种典型碳纳米材料对锦鲫肝脏和鳃的损伤以及对锦鲫抗氧化防御系统影响，初步探讨了2种碳纳米管的暴露浓度、暴露时间与毒性效应的关系，以期为评价低浓度碳纳米管暴露对水生生物的毒性效应，筛选合适的生物标志物提供基础依据。

1 研究方法

1.1 材料

SWCNT，纯度>95%(深圳市纳米港有限公司)；MWCNT-OH(深圳市纳米港有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)，纯度>97%(美国Tedia公司)；实验室用的锦鲫[Carassiusauratus，(25.0±7.5)g, (12.0±0.5)cm](南京市水产研究所禄口养殖基地)；锦鲫饵料(南京水产研究所)；试剂盒(南京建成生物技术公司)。

1.2 实验仪器和用具

超声波细胞粉碎机(JY88-Ⅱ)，超声功率10～250 W，破碎容量0.2～200 mL(南京以马内利公司)；紫外可见分光光度计(Unico UV2000 spectrometry)(上海丽度电子科技发展有限公司)。加热棒、尼龙抄网、曝气头等养鱼器具不可混用，需用稀盐酸浸泡、洗涤剂清洗和自来水冲洗后使用。

1.3 实验前处理

各称取100 mg SWCNT和 MWCNT-OH粉末，放于1 L的烧杯中，加入1 L超纯水，将探头伸入烧杯中，调节底座高度，使探头末端接近底部约2 cm，超声纳米管的功率为75 W，超声3 s后，间歇3 s。经过10 h超声破碎的碳纳米管分散液很稳定，长期静置后未发现沉淀。

1.4 暴露实验

选择健康、无明显疾病和肉眼可见损伤的锦鲫，暴露在室内模拟条件下进行半静态染毒实验。用活性炭净化充足曝气自来水，要求溶解氧达5.0 mg/ L，酸碱度pH 值(7.5 ± 0.4)，水温约22 ℃。在实验室条件下，锦鲫驯养>15 d，健康无病害，每天按时按量投饵，一次投喂饵料适中，每日连续曝气，使水中溶解氧充足。为保证碳纳米管每天的暴露浓度大致保持在同一水平，换水时须加入一定体积且预先配置好的碳纳米管母液。

将锦鲫随机划分若干处理组， SWCNT和MWCNT-OH分别设置4个质量浓度组单独暴露(0, 10, 100, 1 000 μg/L)；光暗比为14 h∶10 h，喂食量每条鱼每天约1.2 mg，一天一次或分多次，记录鱼的体长和质量；每天及时清除食物残渣和粪便。

样品采集时,从每个暴露组捞取5条锦鲫，用钝器击昏，用预冷的缓冲液冲洗，置于冰块上，称量鱼质量、测量体长；迅速把锦鲫腮及肝脏取出,称重，置于冰浴中，用冷的生理盐水冲洗干净，加入1∶9(质量体积比)的冷生理盐水，用手持式电动匀浆机冰浴匀浆，高速冷冻离心机12 000 r/min于-4 ℃离心15 min，上清液立即用于分别测定肝脏中蛋白质含量及酶活性。

1.5 H&E 染色切片

解剖锦鲫后迅速取出肝脏和腮组织，用10%福尔马林缓冲溶液固定48 h，自来水清洗用6—7 h，干燥和石蜡包埋。包埋好的肝脏和腮组织用切片机切片，厚度控制在5 μm，用苏木精-伊红(HE)染色剂染色，完全着色后，再进行二次脱水，浸入伊红染液，染色完成后，梯度脱水和透明。用Nikon Eclipse Ti-U 成像系统拍摄病理图片。切片制作过程都能做到一次进行脱水、透明、渗透、石蜡包埋和切片。

1.6 生物标志物分析

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法按照文献[8]，对在次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶生成 O2·体系中细胞色素 c 还原的抑制情况加以评估。过氧化氢酶(CAT)活性测定方法参考文献[9]；蛋白质浓度测定方法按照文献[10]，采用牛血清蛋白作为标准品。

1.7 数据统计分析

应用Excel、SPSS 19.0软件对测得试验数据进行统计分析，酶活所有结果用5次重复试验数据以“平均值±标准差”的形式表示。采用差异性分析(ANOVA)法对组间数据进行差异性显著分析，p< 0.05 表示在统计上有显著差异，采用Origin 8.0 绘图。

2 结果与讨论

2.1 SWCNT和MWCNT-OH暴露对锦鲫的肝和鳃组织影响

图 1和2是经14 d暴露后，从显微镜中观察到的锦鲫肝和鳃组织的典型图片。图1中黑箭头：动脉瘤；绿箭头：腮丝抬升；红箭头：水肿。图2中黄箭头：坏死；绿箭头：空泡；红箭头：细胞肿大。

通过切片图的比对发现，2种典型碳纳米管不论浓度高低都会对锦鲫鱼鳃产生损伤，低浓度染毒会产生鳃丝扩张、肿大，高浓度染毒(1 000 μg/L)可使鱼鳃失去功能的严重病理症状，如畸形生长、

(a)0；(b) SWCNT (10 μg/L) 没有变化；(c) MWNT-OH (10 μg/L) 没有变化；(d) SWCNT (1 000 μg/L)； (e) MWNT-OH (1 000 μg/L)。图1 SWCNT，MCWNT-OH 2种碳纳米管各自暴露下14 d锦鲫鳃损伤切片

(a) 0；(b) SWCNT (10 μg/L) 没有变化 (c) MWNT-OH (10 μg/L) 没有变化； (d) SWCNT (1 000 μg/L)；(e) MWNT-OH (1 000 μg/L)。图2 SWCNT，MCWNT-OH 2种碳纳米管各自暴露下14 d锦鲫肝脏损伤切片图

鳃动脉瘤和鳃细胞水肿。说明碳纳米管可以对鱼鳃产生较严重的伤害，这可能是因鱼在水里不停的呼吸，不断的过滤水中的碳纳米管，由于碳纳米管的孔径和长度都比较小，能够进入腮组织，从而对鳃造成伤害[11]。腮是鱼一个多功能和复杂组织，鱼要通过腮呼吸和过滤大量的水，所以鱼腮相比较其他器官更易受环境中毒物影响[11]，尤其对碳纳米管更加敏感[12]。

高浓度的SWCNT，MWCNT-OH对锦鲫肝脏造成轻微的损伤，肝细胞出现炎症和细胞浸润以及小的脂肪空泡等症状；而低浓度染毒14 d时，碳纳米管对鱼肝不造成损害。Tabei[13]研究发现MWCNT能够进入细胞中去，并产生细胞毒性，毒性大小与细胞内存在MWCNT多少有关。文献[7]研究证明肝脏也是易受碳纳米材料攻击的器官，并锦鲫肝脏的SOD和 CAT受到抑制与碳纳米材料的浓度呈正相关，肝脏的氧化损伤从高浓度染毒组(1 000 μg/L)肝切片也可以看到肝脏受损伤，干细胞肿大，出现小空泡(不同颜色箭头已经表明)。Smith[5]研究表明，暴露于SWCNT的肝细胞显示核小体(凋亡小体)和核分裂异常的细胞，二氧化钛纳米材料暴露后，肝细胞出现轻微的脂肪变化和脂质化，部分肝细胞出现脂质化，显示浓缩核小体(凋亡小体)[6]。

2.2 SWCNT和MWCNT-OH暴露对鲫鱼肝脏抗氧化防御系统的影响

图3(a)(b)给出了SWCNT不同质量浓度(10, 100 和1 000 μg/L)暴露28 d后肝脏SOD和 CAT活力的变化趋势。图中数据为(平均值±标准偏差)；不同字母，表示与对照组相比的显著性差异(p<0.05)。

图3 SWCNT不同浓度组染毒28 d后对锦鲫肝脏抗氧化酶(SOD和 CAT)活性的影响

SWCNT染毒7 d后，高质量浓度组(1 000 μg/L)SOD酶活性显著受到诱导(p<0.05)，其酶活性增加；随着暴露天数增加，14 d后，质量浓度100和1 000 μg/L组SOD酶活性受到抑制；暴露21—28 d，各染毒组SOD酶活性都受到显著的抑制(p<0.05)，肝脏受到损伤。

SWCNT暴露7 d后，100 μg/L组的CAT受到抑制，其他组酶活变化不大；14 d后，10和1 000 μg/L组CAT活X性受到抑制，而100 μg/L组受到诱导，酶活升高；21 d后，10 μg/L组CAT酶活升高但不显著，100 和1 000 μg/L组CAT酶活受到显著的抑制(p<0.05)，酶活降低；暴露28 d后，各染毒组CAT都受到显著的抑制(p<0.05)，表明肝脏受到损伤。

单壁碳纳米管能够导致藻类氧化应激和抑制其生长[14]。Kang[15]认为单壁纳米管对人和动物显示较强的毒性，而多壁碳纳米管显示较温和的毒性。Shvedova[16]认为纳米材料都能使动物细胞产生氧化应激反应，使细胞损伤。碳纳米管能导致蛋白质氧化和蛋白质抗氧化系统损伤[17]。

图4(a)(b)给出了MWCNT-OH不同质量浓度(10， 100和1 000 μg/L)暴露28 d后肝脏SOD和CAT活力的变化趋势。图中数据为(平均值±标准偏差)；不同字母，表示与对照组相比的显著性差异(p<0.05)。

图4 MWNT-OH不同浓度组染毒28 d后对锦鲫肝脏抗氧化酶(SOD和CAT)活性的影响

MWCNT-OH染毒7 d后，10 和100 μg/L组与空白对比SOD变化不大，1 000 μg/L组 SOD酶显著受到诱导(p<0.05)，其酶增加；暴露14 d后，10 和100 μg/L组与空白对比SOD酶变化不大，而1 000 μg/L 组SOD酶活升高，但变化不显著；21 d后，10 μg/L组SOD酶受到显著的抑制(p<0.05)，SOD减小，其他浓度组变化不显著；28 d后，10 μg/L组SOD活变化不显著，100 和1 000 μg/L组SOD酶活受到显著的抑制(p<0.05)，其酶减小，肝脏受到损伤。

MWCNT-OH染毒7 d后，10和100 μg/L组CAT酶活变化不显著，1 000 μg/L组 CAT酶活受到显著的诱导(p<0.05)，酶活升高；14 d后，10 和100 μg/L组CAT酶活变化不显著，1 000 μg/L 组CAT酶活受到显著的抑制(p<0.05)，酶活降低，肝脏受到损伤；21 d后，10 μg/L组CAT活变化不显著，而100 和1 000 μg/L组CAT活受到显著的抑制(p<0.05)，CAT减小，肝脏受到损伤；28 d后CAT，各染毒组都受到显著的抑制(p<0.05)，CAT酶活减小，肝脏受到损伤。

文献[18-21]研究表明，碳纳米管会对人胚胎肾细胞、老鼠肺细胞和鱼的抗氧化系统造成损伤。MWCNT碳纳米管由于长度、形状、硬度和其他性质的不同导致生物毒性的不同[22]。本研究表明，SWCNT和MWCNT-OH作为外援物质进入鱼体，激起活性氧的升高，而抗氧化酶系统为了对抗活性氧的升高，SOD和CAT增加，当活性氧产生速度超过抗氧化酶速度，抗氧化酶受到抑制，肝脏受到损伤。虽然SWCNT和MWCNT-OH对鱼类的毒性很小，但可对锦鲫肝脏造成轻微的损伤。许多浓度组出现的酶变化情况表明，碳纳米管暴露会给鱼体带来了氧化应激，导致了活性氧自由基等氧化物质的积累，随着浓度增大和染毒天数增加，抑制抗氧化酶的产生。这种变化就形成抗氧化酶防御机制中的“自适应阶段”和“抑制阶段”，“适应阶段”是外源物质的进入诱导抗氧化酶活性的增加，抗氧化酶就能维持机体正常的生理生化平衡；“抑制阶段”，当抗氧化酶不能维持机体正常的生理生化平衡，酶活显著减少，受到显著的抑制，活性氧的累积水平己超过抗氧化防御水平的清除能力[8]。

实验期间，设置了多浓度组与多采样时间点，鱼体内的SOD和CAT的酶活强度呈现多样化的变化，这种变化间接反映了SWCNT和MWCNT-OH暴露能促进鱼体产生不同的生物活性物质。低浓度组染毒早期，呈现SOD和CAT酶活性受到诱导；而高浓度组染毒时间增加，SOD和CAT都相应降低，SOD和CAT受到抑制。总之，外源物质的进入会引起氧化压力强度和氧化胁迫持续变化，抗氧化酶共同发挥作用，以维持活性氧产生和抗氧化防御系统之间的平衡。

根据实验结果和规律可以判断，高浓度SWCNT和MWCNT-OH进入锦鲫体内后，一方面抑制SOD、CAT等抗氧化酶活性，从而增加了锦鲫体内活性氧的积累；另一方面低浓度时SWCNT和MWCNT-OH的进入也会诱导活性氧的产生，过量积累的活性氧反过来消耗SOD、CAT，SOD、CAT酶活降低，锦鲫组织受到损伤。Ganguly[23]研究认为，单壁碳纳米管能诱导活性氧的产生，增加细胞死亡，提高DNA损伤。SWCNT和MWCNT-OH可以诱导锦鲫体内的活性氧的产生，在实验早期阶段，机体为了消除过量的活性氧，加速合成SOD、CAT，表现为SOD、CAT受到诱导，酶活性提高，之后由于活性氧的积累，超过了机体的调节功能，影响SOD、CAT的合成，表现为SOD、CAT活性的下降，此推断符合Mittler[24]的活性氧学说。

研究发现随着染毒时间增加，28 d后，SWCNT和MWCNT-OH高浓度组的SOD和CAT活力均显著降低，说明高浓度下碳纳米管能抑制SOD和CAT活力, 这与朱小山[25]用SWCNT染毒锦鲫的结果是一致的。SOD和CAT活力降低，抗氧化系统受到抑制，锦鲫肝脏内超氧自由基上升，肝功能已经无法对抗这种变化，肝脏受到损伤。经过7 d后染毒，SWCNT和MWCNT-OH在暴露质量浓度为10和100 μg/L时，锦鲫肝脏SOD酶活性变大，暴露初期，会诱导SOD酶活来对抗外源物质干扰。中等浓度和高浓度组随着暴露时间增加SOD和CAT活力大都出现显著下降，说明长时间暴露于碳纳米管对超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性有显著的抑制作用，可能对鱼的肝脏造成损伤。

3 结论

研究评估了亚急性低浓度暴露条件下SWCNT和MWCNT-OH对锦鲫肝脏和鳃组织的损伤和肝脏抗氧化防御系统的影响，发现SWCNT和MWCNT-OH都对鳃造成了不同程度的损伤，高浓度暴露损伤较严重，低浓度组造成的损伤较轻，呈剂量-效应关系；低浓度SWCNT和MWCNT-OH对锦鲫肝脏损伤不明显，可能与碳纳米管毒性较小，难以进入肝脏有关。虽然碳纳米管的毒性较低，但其长期暴露对鱼类的影响仍需进一步关注。