QuEChERS-超高效液相色谱法测定蜂蜜中升华硫

中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093

小蜂螨，又称小螨，是热厉螨属蜜蜂寄生螨，是我国养蜂业面临的主要虫害之一[1]。小蜂螨寄生在巢房中，以蜂幼虫的血淋巴为食，可导致蜜蜂封盖幼虫、蜂蛹衰弱、发育不良、无法羽化，甚至死亡。从而致使蜂群群势减弱，严重者会导致全群消亡[2]。小蜂螨个体小、繁殖迅速[3]，对中、西方蜜蜂均有严重危害，在我国小蜂螨危害性高于大蜂螨[4]。

目前，小蜂螨的防治方法主要有：化学药物、生物防控和物理方法。我国蜂农防治小蜂螨主要以化学药物为主，包括甲酸、升华硫、双甲脒以及菊酯类药物。其中升华硫因具有低毒、高效、价格低廉等特点，已成为目前我国养蜂生产中使用最广泛的防治小蜂螨药物[5]。蜂农通过在蜂箱中撒施、纱布袋落粉、涂抹封盖的子脾、隔王板喷涂、置升华硫粉盒等方法进行施药[6]。由于施药期间，升华硫可通过药物喷洒、蜜蜂携带、升华等途径污染巢脾，造成蜂产品中升华硫污染等问题。

我国食品安全国家标准《GB 2760-2014 食品添加剂使用标准》中规定硫磺最大使用量应在0.1 g/kg（水果干类、食糖）～ 0.9 g/kg（魔芋粉）。目前检测硫磺的方法主要有滴定法、硫酸钡重量法和碘量法等。《GB 3150-2010 食品添加剂 硫磺》通过扣除样品中杂质（灰分、酸度、有机物和砷）的质量分数，来计算硫磺中硫的质量分数，该方法不适宜测定复杂样品中低浓度的升华硫残留。《中国药典》（2005年版和2010年版）采用燃烧-滴定的方法对升华硫含量进行测定，对于水分含量高、基质较为复杂的蜂蜜并不适用。随着色谱技术的发展，已有文献报道采用液相色谱技术对中药硫磺[7]、湖泊沉积物[8]等样品中升华硫进行测定。本文基于上述工作，采用QuEChERS 前处理方法和超高效液相色谱（UPLC）检测技术建立了蜂蜜中升华硫残留的简单、快速、高效检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 标准品与试剂：升华硫（纯度≥99%）购买于Alfa Aesar（美国）；乙酸乙酯、甲醇，色谱纯，购买于Fisher Scientific（美国）；无水硫酸钠（分析纯）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA，40 μm～60 μm）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18，40 μm～60 μm）购买于安捷伦公司（美国）。试验用水均为超纯水。

1.1.2 主要仪器：超高效液相色谱仪（UPLC）配有二极管阵列检测器（DAD）（waters，美国），ACQUITY CSH C18 色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；分析天平（万分之一天平，梅特勒-托利多，上海）；高速离心机（CR22G Ⅱ，日立，日本）；超纯水仪（Integral5，Milli-Q，美国）。

1.2.3 溶液配制：准确称取升华硫标准品10 mg，用乙酸乙酯溶解，配制成100 μg/ml的标准储备液。准确移取适量升华硫标准储备液用乙酸乙酯稀释成浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 μg/ml的标准工作液，供液相色谱仪测定。以升华硫峰面积为纵坐标，标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.2 液相色谱条件

流动相：甲醇-水（95：5，v/v）；流速：0.3 ml/min；检测波长：254 nm；进样量：2 μl；柱温：30℃。液相色谱图见图1。升华硫出峰时间为2.540 min，色谱图中第一个峰为溶剂峰。

图1 升华硫液相色谱图（4.0 μg/ml，出峰时间：2.540 min）

1.3 样品前处理方法

称取蜂蜜样品5.0 g 于50 ml 具塞塑料离心管中，加入5 ml 水，涡旋震荡2 min，使蜂蜜充分溶解；加入10 ml 乙酸乙酯，涡旋振荡10 min，于4℃下8000 r/min 离心5 min。取上清液5 ml 于15 ml 具塞离心管中，加入150 mg C18、50 mg PSA 和900 mg Na2SO4，涡旋振荡1 min，于4℃下8000 r/min 离心5 min。取上层清液1 ml,经0.22 μm PTFE 滤膜过滤后待测。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂和吸附剂的选择

升华硫能够溶于二硫化碳、四氯化碳、三氯甲烷、甲苯、苯、乙酸乙酯等，微溶于乙醇和甲醇，不溶于水。根据文献报道，乙酸乙酯、甲醇均可有效提取升华硫[7,8]。但由于甲醇与水互溶，在本实验中无法作为提取溶剂，因此选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

C18 和PSA是QuEChERS 方法最常使用的吸附剂。蜂蜜主要含有糖（80%）以及少量蛋白质、脂肪、氨基酸等。C18 具有去除脂肪的功能，PSA 可以吸附蜂蜜样品提取液中的糖、脂肪酸、有机酸、酯类等干扰物[9]。因此选用C18+PSA 吸附剂组合，并参考兽药残留检测常用剂量（50 mg C18，150 mg PSA）[10]，对蜂蜜样品基质进行净化，减少干扰。

2.2 检测波长的选择

对升华硫标准溶液在200～400 nm 波长范围内进行扫描，升华硫在254 nm 处吸收值较高且干扰较少，因此选用254 nm 作为最终检测波长。

2.3 线性范围、方法检出限和定量限

标准工作液：分别量取适量标准储备液，用乙酸乙酯配制浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/ml的系列标准工作液，依次从低浓度到高浓度依上述色谱条件进液相色谱测定，将所得峰面积的平均值与所对应的标准溶液浓度做线性回归，结果显示升华硫在0.1～10 μg/ml 浓度范围内呈线性关系：y=10375.2X+72.4 （见图2）；线性相关系数r2=0.9996。

图2 升华硫标准曲线

通过分析5个空白样品，以3倍信噪比计算，得到该方法检出限（LOD）为0.1 μg/ml；以10倍信噪比计算，得到该方法定量限（LOQ）为0.3 μg/ml。该方法检出限和定量限低于食品安全国家标准《GB 2760-2014 食品添加剂使用标准》中规定硫磺最大使用量的最低值（0.1 g/kg）。

2.4 方法回收率和精密度

为考察方法的准确度和精密度，进行了的添加回收试验。按照上述处理和测定方法，选择空白蜂蜜样品，添加4个不同浓度（即0.4 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8 mg/kg），每个水平设5个平行。测定结果见表1。本方法在四个添加浓度水平回收率在75.0%～95.8%之间，批次内RSD为1.01%～2.62%，批次 间RSD为3.79%～4.75%。方法准确度和精密度能够满足检测要求。添加样品和空白样品色谱图见图3。

图3 添加样品（4.0 mg/kg）和空白样品色谱图

表1 回收试验结果

3 结论

本文建立了蜂蜜中升华硫残留的超高效液相色谱检测方法。采用纯水溶解蜂蜜，乙酸乙酯提取，离心去除杂质，经C18和PSA净化，高效液相色谱仪检测，以水和甲醇为流动相进行等度洗脱分离，全部检测流程仅需30 min。本方法的准确度、精密度和灵敏度均经过方法学评价，满足残留检测的要求。相比于“燃烧-滴定法”、“重量法”，QuEChERS-超高效液相色谱法更加快速、简便，适用于检测复杂样品基质中低残留量的升华硫。