金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响*

吴冬梅,潘开瑞

(1.河南省中医院，河南 郑州 450002； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

肾脏组织中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分的过度沉积造成肾纤维化几乎是所有肾脏疾病的必经途径[1-4]，也是肾脏疾病发展到终末期的重要病理表现。因此，积极探索抑制肾纤维化的药物和治疗方法对于治疗肾脏疾病、延缓肾功能衰竭的进展有至关重要的作用。近年研究[5]表明,P38 MAPK信号通路在肾脏纤维化过程中起一定作用。金匮肾气丸药性平稳，建立在治疗肾虚的肾气丸的基础上，具有良好的抗纤维化作用。本研究采用大鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)制备肾纤维化模型，观察金匮肾气丸对大鼠肾间质纤维化的影响，探讨金匮肾气丸治疗肾纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SD大鼠30只，SPF级，150～220 g，5～7周龄，由河南省实验动物中心提供，批号为SCXK(豫)2015-0004，饲养于河南中医药大学第一附属医院动物实验室[SCXK(豫)2011-0013]，室温(22±2)℃，相对湿度 40%～60%，自由摄食饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

金匮肾气丸，购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号15010639；吡非尼酮，购自西格玛奥德里奇生化科技公司,批号Y0001769；Masson三色染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司，批号20180716；兔抗大鼠上皮钙黏素(E-cadherin，批号ab233611)，Ⅲ型胶原(批号ab184993)、肌动蛋白α(alpha smooth muscle actin，α-SMA，批号ab5694)，均购自美国Abcam公司；SP免疫组化试剂盒(批号PV9003)、DAB显色试剂盒(批号ZLI9017)，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(批号208054)、逆转录试剂盒(批号205311)、信使核糖核酸(RNA)提取试剂盒(批号74104)，均购自德国QIAGEN；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号A53225)，购自美国Pierce公司。其他试剂为国产分析纯。CX31光学显微镜，日本奥林巴斯公司产品；凝胶电泳及转膜系统、CHEMIDOC XRS+化学发光成像系统，均为美国Bio-Rad公司产品；ABI 7300荧光定量PCR仪，美国ABI公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将30只大鼠随机分为假手术组、模型对照组、吡非尼酮组(100 μg/g)、金匮肾气丸低剂量组(1.0 g/kg)、金匮肾气丸高剂量组(2 g/kg)，每组6只。 按照董飞侠等[6]单侧输尿管结扎再通大鼠模型的建立方法制备模型。以 20 g/L戊巴比妥钠按 2 μL/g 剂量麻醉大鼠，切开腹部，游离输尿管，结扎左侧输尿管,建立UUO大鼠肾纤维化模型。假手术组对大鼠行腹部切口，游离输尿管，不结扎，缝合。造模结束即灌胃给药，各药物组灌胃相应药物，假手术组和模型对照组灌胃质量分数为5 g/L的羧甲基纤维素钠,1 d 1次，连续 14 d。

1.4 检测指标

末次给药后 24 h，处死大鼠，取左侧肾组织。

1.4.1 肾组织病理学表现

将肾组织置于40 g/L 的多聚甲醛组织固定液中室温下固定 24 h，进行常规脱水，石蜡包埋，厚切片，行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，在200倍光学显微镜下观察病理学表现。

1.4.2 肾间质损伤指数

肾组织处理方法同1.4.1。随机选择5个观察视野，按肾间质损伤程度8项指标进行评分[7]，用Image Pro Plus 6.0计算平均值。

1.4.3 肾组织胶原含量表达

肾组织石蜡包埋，厚切片，在200倍光学显微镜下观察其胶原程度。同时进行马松三色染色(masson-trichrome staining，Masson)，切片。随机选择20个观察视野，蓝色为胶原纤维，用Image Pro Plus 6.0对 Masson 染色肾组织胶原含量进行灰度值分析，计算阳性表达占整个视野的百分比，取平均值。

1.4.4 肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的蛋白表达

采用免疫组织化学法检测。按照SP免疫组化试剂盒说明书，检测大鼠肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的蛋白表达情况。镜下观察棕褐色区域为阳性区域。随机选取20个视野拍照，采用Image Pro Plus 6.0分析阳性面积百分比，取其平均值进行统计。

1.4.5 肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的mRNA表达

采用荧光定量PCR检测。根据RNA提取试剂盒说明书提取100 mg肾脏组织的总RNA。查询Genebank中大鼠Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的RNA序列，β-actin为内参，在CDS区设计引物。引物序列见表1。

表1 引物名称及引物序列

按照逆转录试剂盒荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应。PCR反应总体积为20 μL，组分如下：RCR预混试剂 10 μL，上下游引物各0.5 μL，5倍稀释的cDNA 1 μL，双蒸水 8 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。结果用2-△△CT法分析统计相对基因表达量。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肾组织病理学表现对比

HE染色显示：假手术组肾组织病理形态学无明显改变；模型对照组肾小管扩张明显，间质内成纤维细胞显著增生、胶原纤维表达增多；金匮肾气丸低、高剂量组和吡非尼酮组的上述病变明显改善。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学表现对比(HE染色，×200)

2.2 各组大鼠肾间质损伤指数对比

与假手术组对比，模型对照组的肾间质损伤指数增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比,各药物组肾间质损伤指数均降低(P<0.05)。 金匮肾气丸高剂量组与吡非尼酮组之间肾间质损伤指数对比，差异无统计学意义，均低于金匮肾气丸低剂量组(P<0.05)。见表2。

2.3 各组大鼠肾组织胶原含量表达对比

Masson染色显示：模型对照组肾间质损伤严重，胶原增多；各药物组的胶原表达有不同程度降低。见图2。

表2 各组大鼠肾间质损伤指数对比

图2 各组大鼠肾组织病理学表现对比(Masson染色，×200)

模型对照组肾间质胶原表达明显高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。吡非尼酮组和金匮肾气丸低、高剂量组的胶原相对面积与模型对照组对比，差异有统计学意义 (P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾组织胶原相对面积对比

2.4 各组大鼠肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的蛋白表达对比

免疫组化图片显示：模型对照组大鼠肾组织呈棕褐色；假手术组免疫染色较弱,几乎无浅棕色；药物组胶原的表达从染色强度到面积均明显减轻。见图3。

定量分析结果显示：与假手术组对比，模型对照组的Ⅲ型胶原和α-SMA的蛋白表达升高，上皮钙黏素蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组对比，3个药物组的Ⅲ型胶原、α-SMA的蛋白表达均降低，上皮钙黏素的蛋白表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

A. 假手术组：Ⅲ型胶原表达强度弱。 B. 模型对照组：Ⅲ型胶原表达强度明显增加。 C.吡非尼酮组：Ⅲ型胶原表达较模型对照组减少。 D.金匮肾气丸低剂量组：Ⅲ型胶原表达较模型对照组减少。 E.金匮肾气丸高剂量组：Ⅲ型胶原表达较模型对照组减少。 F.假手术组：α-SMA表达强度弱。 G.模型对照组：α-SMA表达明显增加。 H.吡非尼酮组：α-SMA表达较模型对照组减少。 I.金匮肾气丸低剂量组：α-SMA表达较模型对照组减少。 J.金匮肾气丸高剂量组：α-SMA表达较模型对照组减少。 K.假手术组：上皮钙黏素表达强度高。 L.模型对照组：上皮钙黏素表达明显减少。 M.吡非尼酮组：上皮钙黏素表达较模型对照组增多。 N.金匮肾气丸低剂量组：上皮钙黏素表达较模型对照组增多。 O.金匮肾气丸高剂量组：上皮钙黏素表达较模型对照组增多。

表4 各组大鼠肾组织III型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的蛋白表达对比 灰度值

2.5 各组大鼠肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的mRNA表达对比

与假手术组对比，模型对照组Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA升高，上皮钙黏素的mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，3个药物组的Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达降低，上皮钙黏素的mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠肾组织Ⅲ型胶原、α-SMA和上皮钙黏素的mRNA表达对比

3 讨 论

绝大多数慢性肾病都会导致肾纤维化，炎症是慢性肾病的基本病理表现，也是肾纤维化的启动因素之一。在治疗措施中，通常一类是针对原发肾病病因的治疗，一类是针对肾纤维化的治疗。目前在肾脏的多项病理参数中，肾小管萎缩和肾纤维化改变是判断疾病发展、预后的重要因子[8]。吡非尼酮作为治疗肾间质纤维化及局灶阶段性肾小球硬化已用于Ⅳ期临床，作为抗纤维化药物，其可减弱纤维细胞中趋化因子2和趋化因子12的产生,其中抗氧化作用是治疗纤维化的重要的机制之一。P38 MAPK信号通路的激活所导致的肾小管上皮细胞凋亡以及肾纤维化起到重要作用[9]。

目前有大量的中药对肾纤维化影响的研究，从单味中药、单体、提取物到传统方、经验方，以及成品药，研究内容从基因水平、蛋白水平、代谢水平到细胞基质、信号通路、细胞因子、蛋白活性等。方、药主要以活血化瘀、软坚散结、补益正气等为主。中医药治疗肾纤维化、延缓病情进展有一定疗效。金匮肾气丸来源于《金匮要略》，是补益正气、活血化瘀的代表方，是最早的补肾方剂。研究[10]显示，金匮肾气丸通过抑制单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-SMA、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的表达来减轻肾间质纤维化。

本研究采用单侧输尿管梗阻方法制备UUO肾纤维化模型，以作用机制明确的吡非尼酮作为阳性对照药物，观察金匮肾气丸对其肾间质纤维化的影响。结果显示：金匮肾气丸高剂量同吡非尼酮的疗效相似，能有效改善肾小管上皮细胞的生长，抑制肾间质纤维的表达，减轻炎症的发生，两者差异无统计学意义；而低剂量虽有改善肾间质纤维化的作用，但效果不显著。因此，应将金匮肾气丸剂量优化纳入处方的考量中。此外，金匮肾气丸和吡非尼酮均可减轻肾脏纤维化，各药物组的胶原面积明显低于UUO模型对照组(P<0.05)，其中金匮肾气丸高剂量组、吡非尼酮组的肾间质损伤指数较低，疗效较好。金匮肾气丸和吡非尼酮还可显著下调E-cadherin、Ⅲ型胶原和α-SMA的表达水平。

综上所述，金匮肾气丸可有效减轻肾间质的损伤，减少胶原沉积，降低肾组织中的胶原蛋白的表达。作为中药，金匮肾气丸能通过有效保护肾间质，减轻胶原沉积来发挥治疗肾间质纤维化的作用。