玉米秸秆微氧-厌氧干式发酵性能研究及微生物群落解析

罗欣剑， 孔晓英， 车昊昱， 邢 涛， 甄 峰，6， 孙永明

（1.中国科学院广州能源研究所，广东 广州 510640； 2.中国科学院可再生能源重点实验室，广东 广州 510640；3. 广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室， 广东 广州 510640； 4. 中国科学院大学， 北京100049； 5.吉林大学 动物科学学院，吉林 长春 130062； 6.东北农业大学 工程学院， 黑龙江 哈尔滨 150030）

0 引言

秸秆是我国丰富的生物质资源之一，若处置不当，如采用传统的焚烧处理，会造成严重的环境污染，从而危害人体健康。 干式厌氧发酵技术（发酵原料的TS 含量大于15%）能同时实现秸秆的生态循环利用和能量转化，具有原料适用范围广、沼液产生少等特点，得到了各国的广泛关注和研 究[1]，[2]。

目前，微氧处理在秸秆湿式厌氧发酵过程中已有研究，但所得结果具有争议。 有研究表明，向发酵体系通入适量氧气能增强原料的水解作用，提高甲烷产量，减少有毒代谢物（如乳酸和乙醇）的形成，提高纤维素酶和蛋白酶水解酶的活性[3]。Fu S F 的研究表明，在微氧浓度为5 mL/g 的条件下对玉米秸秆进行预处理后，湿式厌氧发酵产气过程中的产甲烷率最高，比对照组提高了16.24%[4]。Tsapekos P 的研究表明， 在微氧浓度为5 mL/g 的条件下对麦秆进行预处理后，湿式厌氧发酵的产气率最高，比对照组提高了7.2%，且确定了微氧浓度的临界阈值为10 mL/g[5]。 Pedizzi C 的研究表明，以玉米饲料和猪粪为原料，当微氧浓度为4.3，8.8 mL/g 时， 湿式厌氧发酵过程中甲烷的生成率均下降了40%，并且在8.8 mL/g 的微氧浓度下，古菌群落发育较慢， 这表明微氧环境也可能对产甲烷菌的活性产生负面影响[6]。

本文拟采用微氧-厌氧发酵工艺，即在厌氧发酵启动时构建不同的微氧环境， 直接进行高温干式厌氧发酵试验。 通过监测累积产甲烷量、挥发性脂肪酸（VFAs）浓度、pH 值和原料固体降解率等参数，考察玉米秸秆在微氧-厌氧干式发酵过程中的产气特性。 同时，根据不同发酵时间，取样并进行宏基因组分析，研究微氧-厌氧干式发酵过程中细菌和古菌的分布与变化，以探究微生物的演变规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆取自辽宁省营口市， 风干粉碎后过40 目筛备用。接种物取自本实验室正常运行的高温连续搅拌厌氧反应器 （Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR），试验前饥饿培养一周。 试验原料及接种物的特性如表1 所示。

表1 试验原料及接种物的特性Table 1 Properties of feedstock and inoculum

1.2 试验方法

试验使用有效容积为500 mL 的发酵瓶，设置发酵固体（以TS 计）浓度为16.5%，底物有机负荷为170.5 g/L， 添加0.74±0.01 g 尿素以调节发酵体系的C/N 为25。 所有物料加入后从反应器顶端通3 min 氮气以排除空气，再用针筒分别注入定量纯氧，形成不同的微氧浓度。 各试验组的设计见表2。

表2 试验设计表Table 2 The design of experiment

取两个发酵瓶分别添加130 mL 接种物，记录其产气，以扣除试验过程中接种物的产气。 将密闭的发酵瓶置于55±1 ℃的恒温水浴锅中，试验期间每天早晚各手动震荡1 次，当日产气量低于总产气量的1%时，停止试验（每组试验设置3 个平行样）。 所有产气数据和微氧浓度均以VS 计。为分析干式厌氧发酵过程中细菌和古菌的群落演替规律，每组选取两个平行发酵瓶，在发酵的第2，6，10，14，19，27 天在发酵瓶底端取样孔 处取样， 将D-1 组的样品分别标记为D-1-2，D-1-6，D-1-10，D-1-14，D-1-19，D-1-27，以此类推。 样品保存在-20 ℃冰箱内以待分析。

1.3 测试和分析方法

根据APHA 标准方法测定TS 和VS 含量；采用Vario EL cube 元素分析仪 （德国Elementar 公司）测定C，H，N 和O 元素含量；采用雷磁pHS-3C 型pH 计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）测定pH 值；采用Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）测定VFAs 浓度；采用岛津GC 2014 型高效气相色谱测定CH4和CO2等气体的含量。

累积产气率（mL/g） 和累积产甲烷率（mL/g）（以单位质量的VS 计）的计算式为

式中：VSd为降解后原料的固体含量，%；VSf为降解前原料的固体含量，%。

委托生工生物工程（上海）股份有限公司对样品进行宏基因组测序分析。首先进行DNA 提取和扩 增， 使 用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA 的试剂盒提取DNA， 再用琼脂糖凝胶检测DNA 的完整性； 利用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒对基因组DNA 精确定量， 以确定PCR 反应加入的DNA 量。古菌使用槽式PCR 扩增三轮，第一轮使用M-340F （5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'），GU1ST-1000R（5'-GGCCATGCACYWCYTCT C-3'）引物扩增；第二轮使用第一轮PCR 产物进行扩增，PCR 所用的引物为融合了Miseq 测序平台的V3-V4 通用引物：349F[5'-CCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGM GAAW-3']引物和806R（5'-GACTGGAGTTCCTT GGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATC TAAT-3'）引物；然后，引入Illumina 桥式PCR 兼容引物，进行第三轮扩增。细菌则在第一轮中使用引物341F[5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3']， 第两轮PCR 扩增使用引物805R（5'-GACTGGAGTTCCT TGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC3'）， 然后， 在第三轮使用Illumina 桥式PCR 兼容引物扩增。

进行DNA 纯化回收后，定量混合样品，每个样品的DNA 量取10 ng， 使得最终上机测序浓度为20 pmol。 测序在Illumina HiSeq 2000（Illumina，San Diego，USA）上进行。 最后数据经过预处理后再分别进行OUT 聚类分析和生物多样性分析，利用RDP 分类器将获得的序列依次分为域、门、纲、目、科、属6 个水平。

2 结果与讨论

2.1 干式厌氧发酵的产气性能

玉米秸秆干式厌氧发酵期间的累积产气率和累积产甲烷率的变化情况如图1 所示。

图1 累积产气率和累积产甲烷率的变化情况Fig.1 Cumulative gas production and cumulative methanogenic during dry anaerobic digestion

从图1 可以看出：D-1 组 （微氧浓度为0.45 mL/g）的累积产甲烷率最高，为134.27±18.71 mL/g，比D-K 组（对照组）提高了8.11%；D-5 组（微氧浓度为4.51 mL/g）的累积产甲烷率最低，较D-K组降低了55.41%。当微氧浓度为0.45 mL/g 时，可提高玉米秸秆厌氧发酵的累积产甲烷率， 微氧浓度为1.13～4.51 mL/g 时， 累积产甲烷率随着微氧浓度的提升而降低， 这可能是当氧气浓度超过一定范围时， 厌氧产甲烷菌的生长受到抑制而影响了产气效果，这与付善飞的研究结论相一致[7]。

玉米秸秆干式厌氧发酵的产气情况如表3 所示。 由表3 可知：D-1 组的平均甲烷浓度为54.12%，较D-K 组提升了8.92%；当微氧浓度为1.13～4.51 mL/g 时， 各试验组的平均甲烷浓度较D-K 组大幅度降低， 其中，D-5 组的平均甲烷浓度最低，仅为39.63%，较D-K 组降低了20.24%。这可能与好氧细菌的增殖生成了更多的CO2，以及产甲烷菌丰度降低有关[8]。 随着微氧浓度的增大，干式厌氧发酵的固体降解率随之增高，较DK 组提升了19.35%～46.07%。 各试验组的有效产气时间T80（累积产甲烷率到达理论产甲烷率的80%所用的时间）为17 ～22 d，其中，D-1，D-2 和D-5 组的T80较D-K 组延后了1 d，D-3 和D-4组的T80较D-K 组延后了4 d， 即当微氧浓度为2.26～3.38 mL/g 时， 玉米秸秆干式厌氧发酵过程的T80明显延长。

表3 干式厌氧发酵的产气情况Table 3 Gas production performance of dry anaerobic digestion

2.2 VFAs 浓度和pH 值的变化规律

整个发酵周期内VFAs 浓度的变化规律如图2 所示。 从图2 可以看出：在第2 天，各试验组的VFAs 浓度均比D-K 组低， 这是因为氧气的添加减缓了VFAs 的生成速率并避免其快速积累；在第6 天， 仅有D-2，D-5 和D-K 组表现出VFAs浓度的降低， 其余组则表现出VFAs 浓度滞后降低的现象；在第10～19 天，各试验组的VFAs 浓度急剧积累，并在第19 天达到峰值；D-3 和D-4 组的VFAs 浓度在第19 天达到峰值后，又很快消耗至较低水平，其余试验组只消耗了一半的VFAs， 大量VFAs 仍停留在发酵体系中未被利用[9]。

图2 发酵周期内VFAs 浓度的变化规律Fig.2 Variation of total volatile fatty acids during dry anaerobic digestion

干式厌氧发酵过程中VFAs 浓度的变化情况见表4。 由表4 可以看出：从第10 天开始，所有试验组的丁酸浓度均占VFAs 浓度的90%以上，这与Lim J W 在试验过程中观察到的现象相一致[10]。乙酸仅在发酵的前6 天被检测到，第2 天各试验组的平均乙酸浓度为5 409 mg/L； 在第19天，除D-4 组外，其余试验组的丁酸浓度均大于9 200 mg/L，出现明显的丁酸累积现象。

表4 干式厌氧发酵过程中VFAs 浓度的变化情况Table 4 Variation of VFAs concentration during dry anaerobic digestion mg/L

pH 值是反映厌氧微生物生存环境的重要指标。 高温厌氧发酵过程中，底物的水解速率较快，因而容易造成VFAs 的快速积累，发酵液的pH 值也随之急剧下降[11]。 干式厌氧发酵过程中发酵液pH 值的变化情况如图3 所示。 从图3 可以看出：在前6 d ，乙酸迅速被消耗的过程中，所有试验组发酵液的pH 值未出现较大波动； 在第10～19 天丁酸积累的过程中， 所有试验组发酵液的pH 值略有降低，但始终保持在正常水平。

图3 干式厌氧发酵过程中发酵液pH 值的变化规律Fig.3 Variation of pH value of fermentation broth during dry anaerobic digestion

2.3 微氧-厌氧干式发酵过程中微生物群落演替规律

2.3.1 细菌/古菌群落生物多样性

以产气性能为参考， 分别选取D-K，D-1 和D-4 组在第2，6，10，14，19，27 天取样的测试结果，分析在完全厌氧环境、低微氧环境和高微氧环境下，玉米秸秆干式厌氧发酵过程中微生物群落的演替规律。 经过宏基因组测序分析，每个样品的多样性分析指数如表5 所示。各样品的覆盖率均大于0.99，表明大多数的细菌被大概率的检测到， 即测试结果能代表样品的真实情况。Shannon 指数和Simpson 指数均是用来估算样品中微生物多样性的，Shannon 指数越大，说明群落的多样性越高，Simpson 指数越大，说明群落的多样性越低；Chao1 指数可以估计物种总数。 在整个厌氧发酵周期内，微氧组（D-1 和D-4）的细菌和古菌群落的多样性均高于对照组（D-K），表明在微氧环境中，发酵体系的生物多样性得到了提升；在前14 d，D-4 组的细菌群落多样性高于D-1 组，表明高微氧浓度更有利于细菌群落的多样性；在第6～14 天，3 个试验组的古菌多样性呈现出先急剧提升后又急剧下降的现象，推测是产甲烷代谢途径的变化导致古菌群落结构的变化。在整个厌氧发酵过程中，3 个试验组的细菌多样性均呈现出递减的趋势，而古菌多样性则呈现出递增的趋势。

表5 不同样品的细菌和古菌多样性指数分析Table 5 Analysis on bacterial and archaeal diversity index of different samples

2.3.2 细菌群落演替规律

各试验组的细菌群落在门水平的分布如图4所示。 从图4 可以看出：D-K 组中仅存在11 种相对丰度高于1%的门水平物种，远低于D-1 和D-4 组的20 种； 相较于D-K 组，D-1 和D-4 组的Proteobacteria 和Bacteroidetes 在第2，6 天显示出更高的相对丰度； 第10 天，D-1 和D-4 组 的Proteobacteria的相对丰度分别快速提升到54%和49%，Chloroflexi 的相对丰度分别快速提升到6%和27.82%；在第10 天之后，随着发酵时间的延长，3 个试验组均表现出相同的变化趋势，即Firmicutes 的 相 对 丰 度 上 升，Proteobacteria 和Bacteroidetes 的相对丰度缓慢下降。 D-1 和D-4组与D-K 组在门水平的差别主要体现在Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes 和Chloroflexi 的变化。

图4 不同微氧环境下细菌群落在门水平上的相对丰度Fig.4 Relative abundance of Bacteria community at phylum level in different micro-aerobic environments

各试验组的细菌群落在属水平上的相对丰度如图5 所示。 从图5 可以看出：在D-K 组中，随着发酵时间的延长，Clostridium III 的相对丰度 逐 渐 由 33% 降 至 13% ； 在 前 10 d，Defluviitalea 的相对丰度由17%逐渐降至2%，而Solibacillus 的相对丰度则在第10 天急剧升至7%。Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas是D-K 组的主要水解菌属，其协同作用对纤维素的降解有促进作用[12]。

从图5 还可以看出：在D-1 组中，前6 d 的主 要 菌 属 为 Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas， 其相对丰度在第6 天分别达到了9%，20%和14%；在第10 天，3 种主要菌属的相对丰度均急剧降低至4%以下，而Acinetobacter的相对丰度则急剧上升至45%，Levilinea 的相对丰度也提升至3%。 Acinetobacter 是嗜热厌氧环境中的主要菌群， 在糖分的分解过程中发挥作用， 并能够利用酚等苯环结构物质，Acinetobacter 的突然增加与有机质的快速降解密切相关。在第14 天之后，Clostridium III 和Petrimonas 为主要菌属。Clostridium III 是Firmicutes 中的主要菌属，能将复杂大分子转化为醇、氢、二氧化碳和挥发性脂肪酸。 Ziganshin A M 的研究表明，Clostridium III 过多则预示着发酵反应体系的酸败[13]。于佳动的研究表明，Clostridium III 相对丰度的升高不利于甲烷的生产[14]。 而在第10天检测到的Clostridium III 的相对丰度急剧减小，且其相对丰度始终低于其他试验组，对应了D-1 组最高的产甲烷率。 Clostridium III 的变化可能是影响厌氧发酵产甲烷性能的原因之一。

图5 不同微氧环境下细菌群落在属水平上的相对丰度Fig.5 Relative abundance of Bacteria community at genus level in different micro-aerobic environments

从图5 还可以看出：在D-4 组中，前6 d 的主要 菌 属 为 Clostridium III，Defluviitalea，Petri -monas 和Tepidimicrobium，其相对丰度在第6 天分别达到了19%，10%，5%和7%； 在第10 天，4 种主要菌属的相对丰度均急剧降低至1%以下，而Acinetobacter 和Levilinea 的相对丰度分别急剧上升至28%和12%； 在第14 天之后， 仅剩Clostridium III 为主要的菌属。 Levilinea 和Petrimonas 分别是Chloroflexi 和Bacteroidetes 中的主要菌属，都能加强碳水化合物转化为乙酸盐和氢气的能力[15]。

微氧组与对照组在细菌属水平的主要变化体 现 在 Clostridium III，Defluviitalea，Acineto -bacter，Petrimonas 和Levilinea 5 种 菌 属，其 协 同作用使得微氧处理组较对照组有更高的水解作用效果， 这与微氧试验组得到较高的固体降解率相对应。另外，在3 个试验组均观察到能降解丁酸并且耐受氨的Syntrophomonas，其相对丰度在第14 天最高， 但仅为2%， 未能有效地降解丁酸，这与试验中丁酸的积累相对应。可以进一步研究在玉米秸秆干式厌氧发酵过程中添加Syntrophomonas 对缓解丁酸抑制的作用。

2.3.3 古菌群落演替规律

各试验组的古菌群落在属水平上的相对丰度如图6 所示。

图6 不同微氧环境下古菌群落在属水平上的相对丰度Fig.6 Relative abundance of Archaeal community at genus level in different micro-aerobic environments

从图6 可以看出： 在D-K 组中，Methanobacterium 在整个发酵周期内都属于主要菌属，随着厌氧发酵的进行，其相对丰度由97%逐渐降至64%； 与此同时，Methanomassiliicoccus 的相对丰度由0.2%逐渐升至21%。 Methanobacterium 是有机物厌氧处理过程中常见的氢营养型产甲烷菌属，它能利用H2，CO2和甲酸产生甲烷[16]。 Methanomassiliicoccus 下仅有一个种， 即为Methanomassiliicoccus luminyensis， 它 能 利 用H2，CH3OH生长并产生甲烷[17]。 因此，在D-K 组中，氢营养型代谢过程是主要的甲烷产生途径。

从图6 还可以看出：在D-1 组中，在第6～10天，Methanobacterium 的相对丰度由92%急剧降至20%；与此同时，Methanothrix 的相对丰度由2%迅速升至50%； 在第14 天，Methanobacterium 的相对丰度又由20%迅速升至86%，Methanothrix的相对丰度由50%迅速降至3%。 Methanothrix 是厌氧发酵过程中分解乙酸的主要产甲烷菌，并且不利用H2，CO2和甲酸盐[18]。 因此，在第6～14 天，D-1 和D-4 组可能主要进行乙酸型代谢产甲烷途径。 在这个阶段，两种代谢途径的菌属共同作用，生物多样性也最大，与多样性分析相一致。

从图6 还可以看出：在D-4 组中，在第6～14天，Methanobacterium 和Methanothrix 的相对丰度具有在D-1 组中相同的变化趋势； 不同的是，在第10 天，Methanobacterium 的相对丰度降至2%，降幅更大， 且Methanothrix 的相对丰度急剧升至52%，与D-1 组中的变化趋势相同，而D-4 组的有效产气时间更长，这可能与不同主要产甲烷途径菌属的转变有关；在第16 天，Methanothrix 的相对丰度降至18%，降幅较D-1 组更小。 Li W W 认为Methanothrix 和Methanomassiliicoccus 促进了纤维素类原料降解的程度并有助于甲烷的生成，这也与微氧处理组较对照组有更高的固体降解率相一致[19]。

总体而言， 在整个厌氧发酵周期内，D-K 组的优势菌属为Methanobacterium 和Methanomassiliicoccus， 主要进行氢营养型代谢产甲烷途径。 而微氧试验组的优势菌属较D-K 组多出了Methanothrix。 Methanothrix 是乙酸型代谢产甲烷途径的主要菌属。在干式厌氧发酵过程中，微氧环境改变了发酵体系中两种主要产甲烷代谢途径菌属的相对丰度。

3 结论

①当微氧浓度为0.45 mL/g 时，厌氧发酵获得了最大的累积产气率和累积产甲烷率， 分别为244.19±25.53，134.27±18.71 mL/g， 较对照组分别提高了3.40%和8.11%。

②在整个厌氧发酵过程中， 细菌群落多样性呈现出逐渐降低的趋势， 而古菌群落多样性呈现出逐渐升高的趋势；在微氧环境下，Clostridium III，Defluviitalea，Acinetobacter，Petrimonas 和Levilinea 是细菌属水平的主要菌属，Methanobacterium，Methanomassiliicoccus 和Methanothrix 是古菌属水平的主要菌属， 主要菌属的协同作用使得微氧处理组较对照组有更高的水解作用效果和更高的固体降解率。

③在第6～14 天，微氧试验组的Acinetobacter菌属（细菌）和Methanothrix 菌属（古菌）的相对丰度均出现急剧增加的现象； 微氧试验组的主要菌属包含了氢营养型和乙酸型代谢产甲烷途径的菌属，而对照组的主要菌属仅为氢营养型代谢产甲烷途径的菌属。