紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

蒋旭，崔会婷，王珍，张铁军，龙瑞才，杨青川，康俊梅

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

0 引言

【研究意义】紫花苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一，其产量和品质一直是苜蓿产业发展所关注的热点。影响苜蓿品质的主要因素有纤维素、木质素和粗蛋白含量以及能量等，其中木质素和纤维素含量是影响苜蓿消化率和营养价值的重要因素之一。木质素和纤维素是组成植物细胞壁的主要成分，占植物总生物量的绝大部分，对植物正常生长发育非常重要。对牧草而言，纤维素与木质素含量的多少决定牧草消化率和营养价值的高低，牧草木质化程度越高，其消化率越低，营养价值也越低[1-2]。因此，研究苜蓿细胞壁生物合成途径中关键基因的生物学功能，为揭示苜蓿纤维素与木质素合成的分子调控机制奠定基础，并为利用基因工程的方法改善紫花苜蓿品质提供参考。【前人研究进展】纤维素与木质素是由单体聚合而成的大分子有机物质，从单体的合成到聚合均有一系列基因参与完成，从而使植物细胞壁物质合成通路具有多基因调控的特性（图1）。通过对拟南芥等植物木质素、纤维素生物合成机制的研究表明，植物NST转录因子是次生细胞壁物质合成的总开关，对细胞壁生物合成起到关键的调控作用[3-5]。拟南芥中存在3个NST同源基因，NST1和NST2、NST3之间功能存在冗余，共同调控次生壁发育，NST1和NST2基因调节拟南芥花药内壁细胞次生壁发育，并对花药正常开裂起到关键作用[6]；NST1、NST3调控木质部与束间纤维细胞次生壁的合成[4-5]；ZHONG等研究拟南芥三突变体nst1nst2nst3，结果表明突变体茎木质部与纤维细胞次生壁完全缺失，造成植株倒伏[7]，暗示NST对木质素和纤维素合成具有重要的调节作用。研究表明，NST转录因子主要通过激活靶基因启动子区 SNBE元件（Secondary wall NAC binding element）调控基因表达[8]。降低拟南芥NST1和NST3表达量，次生壁物质合成关键基因的表达量受到了不同程度的下调[4-5]。例如，nst1nst3双突变体中4-香豆酸辅酶A连接酶基因（4CL1），咖啡酰辅酶连接酶基因（COMT1），纤维素合酶亚基基因（CesA7, CesA8）等参与次生壁木质素与纤维素物质合成基因表达量显著下调[5]。单子叶植物玉米中过表达ZmNST3/4后能够激活一系列纤维素与木质素相关合成基因CesA4、CesA9、4CL、HCT的表达，从而调控玉米次生壁纤维素与木质素合成[9]。植物次生细胞壁物质合成也会受到激素信号的诱导[10]。赤霉素（gibberellin，GA）是调控植物生长发育的重要激素之一，GA通过诱导植物体内酚类化合物等次生代谢来调节木质素的合成[11]。研究表明，GA信号通路的主要调控方式是通过诱导DELLA蛋白降解完成的[12]。水稻中GA通过解除DELLA蛋白OsSLR1对NAC29/31、MYB103L等次生壁转录调控因子的抑制作用，从而激活NAC-MYB次生壁合成通路，促进纤维素合成[13-14]。水杨酸（salicylicacid，SA）是植物内源激素，对长春花幼苗外源施加水杨酸能够增加PAL、POD酶活性，导致细胞壁木质化程度提高，增强植物的抗逆性，以抵御不良环境胁迫[15]。生产实践中用多效唑（paclobutrazol，PCB）作为一种植物生长调节剂来增加茎秆木质素含量，增强机械强度，防止倒伏[16]。小麦苗期用PCB处理，小麦株高降低，基部茎秆细胞壁加厚，木质素与纤维含量上升，增强了小麦的抗逆性[17]。由此可见，外源激素和植物生长调节剂可诱导木质素和纤维素合成相关基因的表达，对促进植物细胞壁合成有重要的调节作用。【本研究切入点】NST转录因子已在拟南芥、玉米和杨树等植物中开展大量研究，结果表明NST通过激活植物次生壁木质素和纤维素合成途径中一系列相关基因的表达，从而对木质素和纤维素合成起重要的调节作用。紫花苜蓿是优质饲草，木质素和纤维素含量是影响苜蓿消化率和营养价值的主要因素之一，然而苜蓿中关于NST转录因子调控木质素与纤维素合成的分子机制鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究以紫花苜蓿为研究对象，克隆了MsNST转录因子，分析了其在外源激素诱导下的表达模式；通过在拟南芥和苜蓿中超表达MsNST，解析了该基因对苜蓿细胞壁中纤维素和木质素合成以及总糖含量的影响，为揭示细胞壁物质合成的分子机制奠定基础。

图1 纤维素与木质素合成途径示意图Fig. 1 Cellulose and lignin biosynthesis pathway

1 材料与方法

1.1 供试材料与培养

紫花苜蓿中苜1号（Medicago sativaL. Zhongmu No.1）、拟南芥（Col生态型）由中国农业科学北京畜牧兽医研究所饲草遗传育种实验室保存。紫花苜蓿种子置于铺有双层滤纸的培养皿中发芽3d，移栽到1/2 Hoagland营养液中置于植物生长间培养（16 h光照 / 8 h黑暗，温度25℃，湿度60%—70%）。培养30d进行胁迫处理，分别以 20 μmol GA3、250 μmol SA、10 μmol PCB处理12 h，每隔4 h取全部茎段，立即投入液氮冷冻，保存在-80℃冰箱，不处理为对照，每个处理 3个生物学重复。拟南芥种子经过1%升汞消毒，灭菌水清洗7次，播种于1/2 MS固体培养基上，在光照培养箱中培养2周（16 h光照 / 8 h黑暗，22℃，湿度60%—70%），然后移栽到土壤（营养土∶蛭石=1∶1）中生长7周用于后续试验。转基因紫花苜蓿通过扦插扩繁观察表型并进行指标测定。本研究始于2018年开始，所有试验均在中国农业科学北京畜牧兽医研究所饲草遗传育种实验室完成。

1.2 MsNST的克隆

紫花苜蓿总RNA提取参考植物总RNA提取试剂盒说明书操作（Promega，上海普洛麦格生物技术有限公司）。取1μg总RNA，利用反转录试剂盒（Takara，北京六合通生物技术有限公司）反转录为 cDNA。由蒺藜苜蓿MtNST1全长CDS序列（GenBank: GU144511.1）为参考，分别在 5′UTR 与 3′UTR 区设计一对引物MsNST-f/r （表1），以紫花苜蓿cDNA为模板克隆MsNST，通过测序获取MsNST全长CDs序列（北京天一辉远生物技术有限公司）。

1.3 生物信息学分析

利用NCBI的ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测最大开放阅读框；利用ExASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/computepi）预测MsNST蛋白分子量大小、理论等电点和亲水性；利用Protscale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）预测跨膜结构域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白的二级结构；通过Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）以拟南芥NAC1为模板预测MsNST蛋白的三级结构；通过Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行蛋白亚细胞定位分析；利用DNAMAN软件（version 7.0.2）对MsNST序列与拟南芥NST1-3序列进行相似性比对；利用MEGA 6.0软件通过邻接法（Neighbor-Joining method）构建系统进化树。

表1 研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 GA3、SA、PCB诱导下MsNST表达分析

分别取 GA3、SA、PCB诱导下各处理的样品提取总RNA，反转录为cDNA。依据基因的序列设计1对引物qNST-f/r（表1），以紫花苜蓿β-Actin 2为内参，通过qRT-PCR检测各个时间点MsNST基因的表达水平。

1.5 过表达载体PBI121-MsNST的构建与遗传转化

利用W-NST-F/R为上下游引物扩增带有特殊同源臂的PCR产物，将PCR产物与PBI121过表达载体连接，并转入GV3101农杆菌感受态细胞，采用花序浸染法对拟南芥进行遗传转化。另外，将PBI121-MsNST质粒转入农杆菌EHA105中，以紫花苜蓿叶片为外植体，采用根癌农杆菌侵染法进行转化[22]。

1.6 拟南芥中过表达MsNST转基因植株的表型分析

为了筛选阳性转基因拟南芥植株，将 T0代拟南芥种子用1%升汞消毒后种在含kan（50 mg·L-1）的1/2 MS固体培养基上，筛选kan抗性拟南芥转基因植株，设计一对引物Ntest-f/r（表1）进行转基因植株鉴定。为了探索过表达MsNST对拟南芥下胚轴发育的影响，将T2代拟南芥种子消毒后，播种在1/2 MS固体平板上，分别在避光和正常光照条件下生长，挑选20株长势一致的拟南芥株系，其中10株置于同一个平板上，每隔1d统计每株下胚轴长度，共统计5d；另外10株置于培养箱中培养到7周龄，分别对株高、鲜重进行统计。同时，将7周龄拟南芥茎基部第一节用刀片截成0.5cm的茎段，放入75%酒精中真空抽气10min，室温放置5 h固定，将材料转入包埋剂中室温放置过夜。用冷冻切片机（莱卡Y470）将茎部横切，切片厚度为50μm，置于载玻片上，加一滴1%间苯三酚于切片上室温染色2min，然后再加一滴40%浓盐酸进行显色，甘油封片后在光学显微镜（Olympus FV500，日本）下观察拍照。

1.7 纤维素与木质素合成相关基因的表达分析

分别取过表达MsNST的紫花苜蓿与拟南芥转基因植株茎组织提取总RNA，反转录为cDNA。依据基因序列设计1对引物qNST-f/r（表1），以β-Actin为内参基因，利用qRT-PCR分析转基因株系中MsNST的相对表达水平。选取表达量最高的株系检测与纤维素和木质素合成相关合成基因的表达量变化，其中紫花苜蓿分别为MsCesA3，MsCesA6，MsCesA7，MsPAL，Ms4CL，MsCoMT，拟南芥为AtPAL1、At4CL1、AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8（引物见表1），每个反应3个生物学重复。

1.8 总糖、结晶纤维素和木质素含量测定

取生长7周龄转基因与野生型拟南芥各10株，分别置于牛皮纸袋放入鼓风干燥箱烘干至恒重（80℃），利用组织研磨仪将样品粉碎（振动频率为70Hz）。分别称取约300 mg粉末，参考Foster方法进行粗细胞壁分离（cell wall resider，CWR），测定木质素含量[23]。称取100 mg CWR置于试管中，加入72 % 浓硫酸，冰浴30 min，12 000 r/min离心，将上清液稀释10倍，采用植物结晶纤维素检测试剂盒（Solarbio, 北京索莱宝科技有限公司）测定纤维素的含量。分别称取5 mg CWR，用72 %浓硫酸室温水解20 min，用蒸馏水将硫酸浓度稀释到4 %，加热到121℃水解1 h，利用蒽酮比色法测定总糖含量，以上试验均为3个生物学重复。

2 结果

2.1 MsNST的克隆及生物信息学分析

同源克隆获得MsNST的cDNA序列为1 121bp，最大开放阅读框为945bp，编码314个氨基酸（图2）；Blast结果表明，该基因与其它物种的NST同源，故将该基因命名为MsNST；ExASy在线预测MsNST蛋白分子量为36.25 kD，理论等电点为6.84；MsNST全部氨基酸的平均亲水系数为-0.986，表明其为亲水性蛋白质（图3-A）；TMHMM预测该蛋白无跨膜结构域（图 3-B）。该蛋白的二级结构以无规则卷曲为主，占总体的60.83 %，α螺旋占17.52 %，β折叠占4.14 %，转角为17.52 %（图3-C）。以拟南芥NAC1蛋白为模板模拟蛋白三维结构并建模，结果表明 MsNST可能是通过形成中心对称的二聚体结构行使功能（图3-D）；通过Cell-PLoc 2.0软件预测，该蛋白定位在细胞核上（图3-E）。

MsNST与拟南芥3个NST氨基酸序列进行多重比对表明，MsNST与拟南芥AtNST1的相似性较高为55.9%，与AtNST2和AtNST3的相似性分别为51.6%、49%。MsNST的N端序列保守，具有NAC 类转录因子特有的5个保守亚结构域[24]，而C端序列不保守（图4）。进化树分析表明，MsNST与豆科模式植物蒺藜苜蓿MtNST1的亲缘关系最近，不同物种进化树分为单子叶与双子叶2大类，MsNST分布在双子叶植物分支中，表明NST转录因子在双子叶和单子叶植物中存在进化差异（图5）。

图2 紫花苜蓿MsNST的克隆Fig. 2 Cloning of MsNST from alfalfa

图3 MsNST生物信息学分析Fig. 3 Bioinformatics analysis of MsNST

图4 MsNST和AtNST1,2,3的氨基酸序列比对Fig. 4 Amino acid alignment of MsNST and AtNST1, 2, and 3

图5 不同植物NST基因的系统进化树Fig. 5 Phylogenetic analysis of NSTs from different plant species

2.2 不同诱导条件下MsNST的表达分析

植物激素对植物生长发育和形态建成具有重要的调节作用。为了揭示施加外源激素对MsNST表达的调控作用，本研究分别用赤霉素、多效唑和水杨酸处理紫花苜蓿，分析MsNST受激素诱导后的表达特性，结果表明，GA3处理会诱导MsNST表达量上调，在诱导12h时表达量达到最高水平，为对照的2.19倍（图6-A）。施加PCB诱导结果表明，在PCB诱导初期，MsNST基因表达量下调在4h时达到最低水平，是未处理的0.72倍，随后表达量上调，在诱导12h达到最高表达水平，为对照的3.65倍（图6-B）。施加SA诱导初期，在4h时表达量显著降低为对照的0.49倍，随后表达量上调，在 12h时达到最高水平是对照的3.67倍（图6-C）。

图6 利用qRT-PCR检测不同激素处理对苜蓿茎MsNST表达的影响Fig. 6 Effects of various treatments on MsNST expression in alfalfa stems using qRT-PCR

2.3 拟南芥中过表达MsNST的功能分析

为验证MsNST的功能，通过 kan抗性筛选与PCR鉴定过表达MsNST拟南芥阳性株系（图7-B）。随机挑选 6个过表达的转基因株系与野生型相比株高出现不同程度的矮化（图 7-A），其中35S::MsNST-Line4中MsNST表达量最高，是对照的3.47倍(图 7-C)。观测Line4和WT植株下胚轴的生长情况发现，光照条件下35S::MsNST-Line4与 WT的下胚轴长度变化不明显；黑暗条件下，35S::MsNST-Line4下胚轴生长受到抑制，萌发 5天时35S::MsNST-Line4下胚轴长度为9.02 mm，显著短于对照组（11.39mm）（图7-D）。对生长7周龄的转基因和野生型拟南芥株高等指标进行测定，转基因拟南芥株高平均值为27.62cm，与对照相比株高降低了 10.4%；转基因拟南芥鲜重降低（1.12g），比对照降低了20%（图7-E）。

2.4 过表达MsNST对木质素、纤维素及总糖含量的影响

通过对过表达拟南芥35S::MsNST-Line4和WT植株从下数第一节茎段横切，利用间苯三酚-盐酸对细胞壁中木质素染色，显微镜观测发现35S::MsNST-Line4的束间纤维（interfascicular fiber，IF）细胞壁厚度增加（图8-A），统计分析表明Line4束间纤维细胞壁平均厚度为 1.58μm，WT细胞壁厚度为 0.92μm，与WT相比过表达MsNST纤维细胞壁厚度增加了71.7%（图8-B），暗示MsNST对束间纤维细胞壁的合成具有一定调节作用。对过表达 Line4株系的木质素和纤维素含量测定表明，转基因植株细胞壁木质素含量相比WT提高了11.7%（图8-C）；Line4株系结晶纤维素含量为 239.15 mg·g-1，是 WT的 1.13倍（图8-D）；总糖含量为355.55mg·g-1，比WT提高了7%（图8-E）。

图7 转基因拟南芥鉴定与表型分析Fig. 7 Identification and phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

图8 过表达MsNST对细胞壁厚度及木质素、纤维素和总糖含量的影响Fig. 8 Effects of overexpression MsNST on cell wall thickness, lignin, cellulose and total sugar content in transgenic Arabidopsis thaliana

2.5 过表达 MsNST拟南芥中纤维素和木质素合成关键基因的表达分析

为了揭示MsNST对次生壁纤维素和木质素合成关键基因的调控作用，利用qRT-PCR检测Line4株系中次生壁纤维素合成关键基因AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8和木质素合成相关基因AtPAL1、At4CL1和AtCOMT的表达量水平，结果显示过表达MsNST提高了次生壁纤维素合酶亚基基因AtCesA4，7，8的表达水平，其中AtCesA7表达量上调最为明显，是野生型的2.81倍；木质素合成关键基因AtPAL1, At4CL1和AtCOMT的表达水平也提高，分别是对照的1.64倍，1.77倍和2.28倍（图9）。

2.6 过表达 MsNST紫花苜蓿的鉴定与木质素和纤维素合成相关基因的表达分析

经抗性筛选获得抗kan的紫花苜蓿株系，经鉴定获得的4株过表达转基因株系，其中OE1表达量最高，是对照的2.7倍（图10-A, B）。生长1个月的OE1植株高度为23.45cm，低于对照组26.32cm（图10-C）。从顶端往下测定6个节间长度的结果表明，从第二个节间开始明显短于对照组（图 10-D）。qRT-PCR分别检测各转基因株系中MsNST的表达量，结果表明过表达株系OE1中MsNST表达量显著上调，是对照组的2.74倍。对纤维素与木质素合成关键基因的表达分析表明，纤维素合成关键基因MsCesA6和MsCesA7表达量上调表达，分别为对照的1.45倍和1.43倍（图10-E）。木质素合成关键基因MsPAL、Ms4CL和MsCOMT也得到不同程度上调，其中MsPAL表达量最大，是对照的1.5倍（图10-E）。

图9 过表达MsNST基因拟南芥中纤维素与木质素合成相关基因的表达分析Fig. 9 Expression analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis in overexpression MsNST transgenic Arabidopsis thaliana

图10 过表达MsNST紫花苜蓿的获取及其木质素和纤维素合成相关基因的表达分析Fig. 10 Identification of transgenic alfalfa and analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis of transgenic lines

3 讨论

NAC家族的NST转录因子是植物特有的转录因子，调控植物次生壁物质合成[3-5,7,9,25]。OOKA在分析拟南芥和水稻 NAC转录因子的保守性时，发现 N端含有A、B、C、D、E 5个保守的结构域[24]。本研究将MsNST氨基酸序列与拟南芥3个同源基因进行相似性比对，结果表明在N端也具有5个典型的NAC保守结构域，与Ooka的分析结果一致；然而MsNST氨基酸序列的C端不保守，可能是导致该基因的功能具有多样性的主要原因（图 3）。系统进化树分析显示，不同植物的NST分为单子叶和双子叶两个分枝，暗示不同物种之间存在一定程度的进化；但是MsNST与豆科模式植物蒺藜苜蓿NST1的同源性最近，表明其可能与MtNST1具有相似的功能。前人研究表明NAC类转录因子大都通过两个反向平行的β折叠片和2个盐桥作用形成同源或异源二聚体，起到转录激活或抑制作用，其中N端保守的精氨酸（R）和谷氨酸（E）位点对盐桥形成起到关键作用[26]。对MsNST蛋白序列分析表明，N端保守序列中具有参与盐桥形成的精氨酸和谷氨酸保守位点，三级结构预测也表明其能够通过两个β折叠形成同源二聚体结构，表明MsNST很可能通过形成同源二聚体结构对靶基因起作用。

GA是植物内源激素，在植物次生壁发育中起到重要作用。研究表明，烟草内源GA3含量增加会提高茎的木质化程度[27]。拟南芥和白桦外源施加 GA也显著增加茎中木质部的面积占比[28-29]。此外，水稻OsSLR1是一种受GA信号诱导裂解的DELLA阻遏蛋白，可以直接与 OsNAC相互作用，抑制NAC-MYB级联反应，调控次生壁合成基因表达[13]。以上研究结果与本研究中GA3诱导MsNST表达水平升高相符合（图5-A），表明在紫花苜蓿中GA3具有激活MsNST表达的作用。生产中常用植物生长调节剂多效唑（PCB）降低顶端优势，增加壁厚，提高植株耐逆性。施加PCB能够显著提高茎秆中PAL和 CAD等酶活性，增加植物次生壁厚度，促进茎秆木质素积累，增强植物茎秆的抗倒伏能力[17,30-31]。研究表明PCB抑制植物体内GA的生物合成[32]，本研究施加PCB短期内（0—4h），MsNST表达量受到PCB影响而降低，可能是 PCB抑制了植物体内的GA合成，降低MsNST表达。PCB处理 4—8h时MsNST表达量显著提高，这与施加PCB能够提高植株茎中细胞壁厚度与积累木质素相符合。然而，PCB导致次生壁NST类转录因子激活的分子调控机制还未见报道，笔者猜想PCB可能还存在其他途径直接或间接影响MsNST表达，具体分子调控机制还需要进一步的研究。SA是植物响应生物胁迫的应激反应激素，由苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）催化合成的肉桂酸盐经苯甲酸盐合成[33]。外施SA 12h提高了MsNST的表达水平，表明 SA能够通过诱导MsNST表达促进细胞壁积累木质素和纤维素，增加植物对病原菌的抵抗能力[15,34-35]，但是SA诱导初期MsNST表达量出现明显下调的现象还没有明确的研究结果。

拟南芥、玉米和杨树等植物中，过表达NST会造成纤维细胞次生壁增厚，细胞壁中纤维素与木质素含量显著增加[5,9,25,36]。此外，拟南芥nst1nst3和截形苜蓿mtnst1突变体中，由于NST的突变，造成植物茎纤维细胞次生壁缺失，木质素与纤维素含量显著降低[4-5,37]。本研究在拟南芥与紫花苜蓿过表达MsNST，导致转基因植株矮化，各节间高度受到抑制。此外，拟南芥花序茎束间纤维细胞壁增厚，细胞壁结晶纤维素与木质素含量显著增加，表明MsNST与其它植物中NST转录因子的功能相似，在调控纤维素与木质素生物合成过程中起到重要作用。笔者还发现MsNST影响黑暗条件下拟南芥下胚轴发育，暗示MsNST可能在拟南芥下胚轴发育时参与细胞壁物质合成。研究表明，许多纤维素和木质素合成相关基因表达受到NST的影响，从而影响次生壁纤维素与木质素合成，例如AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8是组装拟南芥次生壁CSC必须的亚基，对植物次生壁纤维素合成起到关键作用[38-41]。研究表明，拟南芥MYB46及其同源基因MYB83是SND1/NST3转录因子的直接靶基因，MYB46通过反应顺式调控元件（SMRE）直接结合CesAs的启动子，形成保守的 NACs-MYBs-CesAs纤维素合成基因调控网络[42]。木质素合成调控机制还未明确，但是拟南芥PAL1、4CL1、COMT等木质素合成过程中重要酶基因表达都受到 NST转录因子的影响[3-5]。豆科模式植物蒺藜苜蓿与单子叶玉米中NST突变导致纤维素和木质素合成关键基因表达量下调[9,37]。本研究对过表达MsNST拟南芥和紫花苜蓿转基因株系的纤维素与木质素合成基因定量分析表明，MsNST对纤维素和木质素合成相关基因的表达具有一定的调节作用，从而促进纤维素与木质素合成。本研究初步揭示了紫花苜蓿MsNST转录因子在细胞壁纤维素和木质素合成中的正调控作用。

4 结论

本研究克隆了紫花苜蓿木质素和纤维素合成过程中的关键基因（MsNST），该基因在细胞壁木质素和纤维素合成中起到正向调控作用，激活下游基因表达。MsNST基因隶属NAC转录因子家族，并具有该家族的特有的 NAC保守结构域。MsNST受到外源激素GA3、PCB和SA诱导表达。