血凝和血凝抑制试验

陈美艳，罗福斌，任 芬

（1.新平县动物疫病预防控制中心，云南新平 653400；2.新平县畜牧站，云南新平 653400）

血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术，也可用已知标准阳性血清（抗体）监测是否有该病毒（抗原）的存在。实验室用血凝、血凝抑制试验检测鸡血清中禽流感和新城疫抗体，其血凝反应（HA）可以理解为，禽流感病毒和新城疫病毒或其血凝素能和鸡红细胞发生凝集反应致使红细胞不能自然沉降。血凝抑制反应（HI）理解为，当禽流感和新城疫工作抗原和血清样品中抗体反应后，则红细胞就不能再与工作抗原发生反应，这时红细胞就呈现出自然沉降现象，当血清样品抗体不足以和工作抗原反应时，工作抗原就和红细胞发生凝集反应。

1 材料与方法

1.1 供试材料和试剂

96孔U型微量反应板、移液枪及配套滴头，禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H9亚型阳性血清、阴性血清、体积分数为1%鸡红细胞悬液、灭菌生理盐水和加样槽。

1.2 试验方法

为避免出现红细胞自凝现象，一般选用至少3只健康公鸡分别采血，并清洗红细胞后配制成体积分数为10%红细胞悬液，最后配制成体积分数为1%红细胞悬液。若1%鸡红细胞悬液用量大于100 mL时也可直接配制。一般按照等比例混匀体积分数为1%鸡红细胞悬液，如在试验过程中遇到特殊情况，无法满足等量比例混合时也可适当调整比例。整个试验过程只能使用同1份鸡红细胞悬液，并保持混匀以确保红细胞均匀；如有红细胞破裂或者被污染情况，试验无效。

1.2.2 血凝（HA）试验，即抗原效价

按照中华人民共和国国家标准进行血凝试验，根据熟练程度选择平行测定抗原血凝效价，一般选择3个平行测定，U型微量反应孔反应体系为0.075 mL混合液。使用抗原：禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，批号：2018006，生产日期：20181228，有效期至20201227，生产厂家：哈尔滨维科生物技术有限公司。

1.2.3 4HAU抗原标定试验

选用4单位抗原、2单位抗原、1单位抗原，1/2单位抗原、1/4单位抗原和1组生理盐水对照进行标定。U型微量反应孔反应体系为0.05 mL混合液。

1.2.4 血凝抑制试验（HI）

按照中华人民共和国国家标准进行血凝抑制试验，U型微量反应孔反应体系为0.075 mL混合液。使用阳性血清名称：禽流感病毒H9亚型阳性血清，批号：2018002，生产日期：20180906，有效期至20200907。生产厂家：哈尔滨维科生物技术有限公司。

2 结果与分析

2.1 抗原血凝（HA）试验

室温23 ℃下静置40 min观察结果。图1、图2为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝试验结果。

以完全血凝（将反应板倾斜时红细胞不滑落）的抗原最高稀释倍数为一个血凝单位（HAU）为判定标准，该试验对照孔上层清亮，红细胞完全沉降，故将上述抗原血凝的终点滴度判定为1∶512，则4HAU工作抗原的稀释倍数为1∶128。同时也配制稀释倍数为1∶64 的工作抗原。

全内脏反位(Situs Inversus Viscerum)又称“镜面人”或“镜像人”，是指人的心脏、 肝脏、脾脏、胆囊、肾脏、胃、肠等器官的解剖位置与正常人完全相反。此种病例极其罕见，最近本院脊柱外科收治1例“镜面人”合并腰椎间盘突出症病例，采用经Quadrant通道系统椎间孔腰椎椎间融合术(Mis-TLIF)治疗，现将诊治过程报道如下。

2.2 4HAU抗原标定试验

将上述抗原血凝的终点滴度判定为1∶512，4HAU工作抗原的稀释倍数为1∶128，即0.1 mL抗原悬液混入12.7 mL生理盐水中充分混匀。

标定结果如图3、图4。4单位抗原、2单位抗原完全凝集，1单位抗原少于85%凝集，1/2单位抗原红细胞流淌，判定工作抗原液中抗原稍微偏少，所测血清抗体滴度可能偏高。

将上述抗原血凝的终点滴度判定为1∶256，4HAU工作抗原的稀释倍数为1∶64，即0.1 mL抗原悬液混入6.3 mL生理盐水中充分混匀。

标定结果如图5、图6。4单位抗原、2单位抗原、1单位抗原完全凝集，1/2单位抗原约为60%凝集，判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所测血清抗体滴度可能偏低。

将1∶128的工作抗原和1∶64的工作抗原进行1∶1（5 mL+5 mL）混匀标定结果如图7、图8。4单位抗原，2单位抗原，1单位抗原完全凝集，1/2单位抗原约为50%凝集，判定4HAU工作抗原液配制准确。

2.3 血凝抑制试验（HI）

本次试验所测阴性血清滴度小于1 log2，阳性血清滴度大于说明书1个滴度，试验结果有效。图9为本次试验所测阴性血清滴度，图10、图11为所测阳性血清滴度。将反应板倾斜时3种4HAU工作抗原所测阳性血清都是第8孔和生理盐水对照孔中红细胞的流淌状态一致。

3 结 论

3.1 抗原血凝的终点滴度判定以红细胞不流淌为标准

所配制4HAU工作抗原标定时，1单位抗原孔中红细胞没有达到100%凝集。工作抗原液中抗原稍微偏少，其所测血清抗体滴度可能会偏高。

3.2 抗原血凝的终点滴度判定以红细胞出现沉降为标准

所测抗原血凝效价为1∶512，所配制的4HAU工作抗原标定时，1/2单位抗原大于50%以上凝集，且1/4单位抗原孔中红细胞流淌状态没有达到生理盐水对照孔中红细胞的流淌标准。判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所测血清抗体滴度可能会偏低。

3.3 将两种工作抗原悬液以1∶1比例混匀后标定

4HAU工作抗原液标定时完全符合工作抗原标定要求。

3.4 将3种工作抗原悬液用于测定禽流感病毒H9亚型阳性血清

其HI滴度完全一致并无差异。