宣威野生药用植物滇龙胆倍性鉴定研究

张文平，刘小莉，顾庆党

（1.宣威市农业农村局经济作物技术推广站，云南宣威 655400；2.云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500；3.宣威市利用外资办公室，云南宣威 655400 ）

龙胆是常用中药，有清热燥湿，泻肝胆火之功效，《中国药典》1995年版一部规定为龙胆科植物条叶龙胆、龙胆、三花龙胆或坚龙胆的干燥根和根茎。前三种习惯称“关龙胆”，后一种习惯称“坚龙胆”。坚龙胆原植物即滇龙胆，为多年生草本，须根肉质。主茎粗壮，有分枝。花枝多数丛生，紫色或黄绿色。花多数簇生枝端呈头状；花冠蓝紫色或蓝色，冠檐具多数深蓝色斑点，漏斗形或钟形。蒴果椭圆形或椭圆状披针形。花果期8-12月。

染色体是遗传物质的载体。生物染色体的重组常常导致新种的出现，甚至进化就是选择压力与染色体变化互相作用的结果，染色体在一定程度上能反映生物的本质。倍性鉴定是倍性育种及其应用的重要环节。染色体倍性的了解对于品种的鉴定、杂交组合的选配、杂交后代材料的提前筛选、亲缘关系的鉴定等均具有十分重要的意义。目前未见滇龙胆的染色体研究报道。染色体计数法是目前确定植物染色体倍性最直接、最准确的方法，一般分为取材、预处理、固定、解离、染色、制片、镜检和制作永久玻片等步骤。

1 材料与方法

1.1 供试材料

系《全国第四次中药资源普查》宣威普查队尤兴良等于2020年2月17日取材于宣威市阿都乡，经云南省中医大学刘小莉副教授鉴定为滇龙胆材料取回后于花盆栽植备用。

1.2 实验方法

本实验参考陈达菊、杨青等人《三七根尖染色体倍性鉴定技术研究》的方法进行。

1.2.1 取材部位

选用茎尖。

1.2.2 取材时间

分别于8:00、9:00、10:00、11:00、12:00取材，用相同的方法处理进行试验。

1.2.3 预处理

采用5种方法预处理，各处理：

① 秋水仙碱处理1 h；

② 对二氯苯处理1 h；

③ 8-羟基喹啉处理1 h；

④ 秋水仙碱0.5 h+对二氯苯混合液处理0.5 h；

⑤ 水浸泡 1 h。

1.2.4 前低渗

吸掉预处理液，用蒸馏水洗1次，然后加蒸馏水浸1 h，使细胞膨胀，以利于染色体铺展。

1.2.5 固定

用卡诺固定液（酒精∶乙酸＝3∶1）于常温固定4～24 h。

1.2.6 解离

取出固定好的材料加1 mol/L的HCL,置60℃水浴解离5 min、10 min、15 min,水浴解离期间轻摇数次，以促使解离均匀。解离后于45%乙酸浸20 min软化。

1.2.7 染色

卡宝品红染色2～15 min。

1.2.8 压片镜检

采用常规压片法进行压制，显微镜下观察滇龙胆染色体，并对染色体图像拍照。

表1 不同采样时间染色体分离效果比较

2 结果与分析

2.1 茎尖采样时间对比（表1）

比较不同取材时间获得中期分裂相细胞，分析分裂高峰。

由表1知，以10:00～11:00为最佳取材时间。

2.2 预处理方法对比（表2）

由于细胞分裂中期持续的时间很短，一般只有10～30 min，在正常情况下固定材料，中期分裂相较少，而且即便是处在分裂中期的细胞，由于染色体紧密排列在赤道板上，因此在制片过程中很难将染色体分散开，难以观察计数，一般采用化学和物理方法对材料进行预处理。

由表2知，以秋水仙碱处理0.5 h +对二氯苯处理0.5 h方法，效果最好。

2.3 解离时间对染色体的影响（表3）

解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平。本研究设计3个处理时间，分别为5 min、10 min、15 min。

由表3知，5 min处理时，茎尖分生区边沿细胞分散，染色体不分散且模糊，解离效果差；10 min处理时，茎尖分生区整体细胞分散，染色体分散且清晰，解离效果最好；15 min处理时，大量的茎尖分生区细胞去壁后容易粘连堆集，不利于压平铺展，染色体出现碎片化游走或堆积，效果差。

3 结论与讨论

3.1 结 果

通过实验结果表明，野生滇龙胆根系肉质，不适宜水培。茎尖取材时，在室内盆栽条件下10：00～11：00为最佳取材时间，先用秋水仙碱处理0.5 h后再用饱和对二氯苯处理0.5 h为最佳预处理方法，最佳解离时间为10 min。

3.2 讨 论

通过大量的重复试验，探索出滇龙胆染色体制片的技术方法，确定宣威野生药用植物滇龙胆的染色体条数为22条（见图1），茎尖分生组织为正常的二倍体2n = 22。研究中，由于采集的野生样本有限，加之栽培后长势不算均匀，染色体制片前取样受温度、环境和各生长阶段芽长势等多种因素的影响，大多时候制片得到的染色体均为软染色体，给观察分析带来一些困难，具体原因有待进一步探索。

表2 预处理方法比较

表3 解离时间研究对比

染色体倍性化在植物进化、作物品种改良上作用重大，在遗传育种、优良农艺性状利用上还将发挥越来越重要的作用。准确鉴定植物倍性水平是发挥其作用的重要环节。