人工感染禽腺病毒血清4型病毒对鹅组织中免疫相关因子基因表达的影响

任梦婷，姜 磊，刘亮亮，李慧昕，张莉莉，侯雨彤，马得莹

(1.东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069)

天然免疫系统是机体抗感染的第一道防线，部分天然免疫通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)[1]。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是最重要的PRRs之一，目前，在禽体内已经发现10种TLRs，不同TLRs在细胞内定位不同，识别不同的PAMP，TLRs识别特异性配体后，通过激活MyD88依赖性或MyD88非依赖性途径激活下游信号转导途径，引发机体抗病毒反应和炎症反应，进而诱导防御素、促炎细胞因子和干扰素等免疫相关因子的表达,以抵御入侵的病原体[2]。防御素是一种富含半胱氨酸的内源性阳离子多肽，对细菌、真菌及病毒具有广谱抗性，属于抗菌肽的一个基因类别[3]，禽类体内的防御素均为禽β-防御素(avian β-defensin，AvBDs)，AvBDs参与宿主天然免疫反应[4]。研究发现防御素可以激活树突状细胞，并且调节干扰素(interferon,IFN)-γ表达，表明其可能在特异性免疫中发挥作用[5]。细胞因子参与细胞免疫、体液免疫以及炎症反应等重要生理学过程，是天然的治疗剂和疫苗佐剂的优良候选者，IL-18可以促进IFN-γ产生[6]，IFN-γ参与多种免疫调节过程，具有较强的抗肿瘤、抗细胞分裂以及抗病毒功能[7]。与适应性免疫相比，先天免疫系统具有作用范围广、反应速度快、相对稳定等优点。

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)为线性双股DNA病毒，无囊膜，大小为43～45 kb[8]。1987年，巴基斯坦的安卡拉哥特地区首次发现FAdV[9]，后来陆续在世界各地出现FAdV感染，给世界各国养禽业造成巨大经济损失。在2010年，中国也出现关于FAdV严重感染的报道[10]。感染FAdV可以引发禽类心包积水综合症(hydropericardium syndrome，HPS)、包涵体肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)和肌胃糜烂(gizzard erosions，GE)等疾病[11-12]，3～5周龄肉仔鸡死亡率高达100%[13]。2015年，我国多个省份暴发FAdV-4感染，造成巨大经济损失[14]。不同腺病毒感染不同宿主，2010年，匈牙利某鹅养殖场暴发急性疾病，经鉴定为GoAdV[15]；2016年我国首次报道了国内鹅群感染FAdV-4病例，但并未进行深入研究[16]，FAdV对水禽养殖业存在威胁。

FAdV基因型和血清型众多，变异和重组难免发生，不同物种间可能产生交叉感染，国内腺病毒感染可能与污染FAdV活疫苗和垂直传播有关[17]。所以，疫苗免疫并不能彻底保护机体免受病毒入侵。本试验以FAdV-4感染鹅，系统研究脾脏、哈德氏腺、骨髓、法氏囊和盲肠扁桃体中免疫相关基因mRNA表达水平及病毒载量，了解鹅抗FAdV先天免疫机制，为预防和治疗FAdV提供试验基础和新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只30日龄健康鹅，由哈尔滨国生生物科技股份有限公司实验动物中心提供；FAdV-4(HN/151025)病毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽呼吸道创新团队提供，病毒GenBank登录号为KU245540.1。

1.2 主要试剂One Step SYBR®Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ试剂盒(Cat.#RR086A)、SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ (Perfect Real Time)、ExTaq DNA聚合酶、RNAiso Plus和琼脂糖均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；异丙醇、三氯甲烷和无水乙醇等均为实验室分析纯。

1.3 动物试验将50只30日龄健康鹅随机分为3组，攻毒组(30只)和对照组(20只)，经滴鼻点眼接种106.5×TCID50鸡源FAdV-4强毒株(HN/151-025)0.1 mL/只，对照组接种同种剂量PBS，隔离饲养，自由采食和饮水。在攻毒后36,72 h和7,21 d，分别在攻毒组和对照组随机选取5只鹅，采取脾脏、哈德氏腺、骨髓、法氏囊和盲肠扁桃体冷冻保存。剩余10只鹅为固定观察组，用于观察并记录临床症状。

1.4 引物设计及合成根据GenBank上已发表的鹅18S rRNA基因序列设计特异性引物(表1)，鹅AvBDs、细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ)、TLRs(TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15)参考XU等[18]，MyD88引用WEI等[19]引物，上述引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.5 组织总RNA提取按照Trizol方法[18]提取组织总RNA，用70 μL DEPC水溶解，-70℃保存备用。

1.6 实时荧光定量RT-PCR标准品的制备以鹅骨髓提取的组织总RNA为模板，用设计的基因序列特异性引物，荧光定量RT-PCR方法扩增目的片段，回收克隆到PMD18-T载体上，构建重组质粒。

表1 荧光定量RT-PCR引物序列

1.7 实时荧光定量RT-PCR将重组质粒标准品连续10倍稀释8个梯度，用于构建标准曲线。以各组织总RNA为模板，使用表1所示的特异性引物进行实时荧光定量RT-PCR扩增，每个样品做3个重复，取其平均值。PCR反应体系25 μL：2×one step buffer 12.5 μL；RNA Free dH2O 7.5 μL；PrimeScript one step Enzyme Mix 1 μL；Forward Primer(2.5 μmol/L)1 μL；Reverse Primer(2.5 μmol/L)1 μL；RNA 2 μL。PCR反应程序：42℃反转录5 min；95℃预变性10 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环；40℃延伸30 s。

2 结果

2.1 经FAdV-4感染后，鹅各组织病毒载量在鹅感染FAdV-4后的不同时间点，通过荧光定量RT-PCR方法，检测病毒在各组织中的病毒载量，结果显示对照组中各组织在不同时间点均未检测到病毒分布。在攻毒组中，法氏囊在攻毒后36 h和3 d，哈德氏腺在攻毒后7 d以及盲肠扁桃体在攻毒后21 d检测到病毒(图1)，试验攻毒成功，鹅能够感染FAdV-4，但临床症状及解剖结果发现，鹅只无明显的发病和死亡现象。

图1 鹅经FAdV-4感染后各组织的病毒载量

2.2 FAdV-4感染后TLRs在鹅组织中表达量在鹅感染FAdV-4过程中，5个免疫组织均未检测到TLR4基因表达，其他TLRs在各组织中广泛表达，并且存在差异。感染FAdV-4后，与对照组相比，TLR1在哈德氏腺(7和21 d)表达量显著下调(P<0.05)，在法氏囊(21 d)中表达量显著下调(P<0.05)。TLR2在脾脏中(36 h)表达量显著上调(P<0.05)。TLR3(72 h)在脾脏中被诱导表达(P<0.05)，但在哈德氏腺(72 h和21d)、骨髓(72 h)以及在感染后期(7和21 d)的法氏囊表达量显著下调(P<0.05)。TLR5在脾脏和盲肠扁桃体(7 d)中表达量显著上调(P<0.05)，在法氏囊(36 h)、哈德氏腺(72 h)以及骨髓(7 d)中表达量显著下调(P<0.05)。TLR7在盲肠扁桃体(36 h)、骨髓(7 d)和法氏囊(21 d)中表达量显著下调(P<0.05)。TLR15在骨髓(36 h)以及盲肠扁桃体(7和21 d)中表达量显著上调(P<0.05)；但在法氏囊(36 h)、骨髓(72 h和7 d)、脾脏(21 d)以及感染后期的哈德氏腺中基因表达量显著下调(P<0.05)(图2)。

2.3 FAdV-4感染后TLRs信号通路关键基因在鹅组织中表达量FAdV-4感染后鹅体TLRs信号通路基因在不同时间点和不同组织器官内广泛分布，基因表达量呈现出显著性变化。MyD88在法氏囊(36 h)中显著上调(P<0.05)，在脾脏(72 h)中基因表达量显著下调(P<0.05)；感染后7 d，MyD88基因表达无显著性变化；在盲肠扁桃体和法氏囊(21 d)中基因表达量显著下调(P<0.05)。TRIF在哈德氏腺(36 h)、脾脏(72 h)和盲肠扁桃体(7,21 d)中表达受到抑制(P<0.05)；在骨髓(7 d)表达量显著上调(P<0.05)。Rel在盲肠扁桃体(36 h)中基因表达量显著下调(P<0.05)；感染后72 h，盲肠扁桃体中基因表达量显著上调(P<0.05)，但在骨髓中基因表达受到抑制(P<0.05)；感染后7 d，在盲肠扁桃体中基因表达量显著上调(P<0.05)，在脾脏和骨髓中表达量显著下调(P<0.05)；感染后21 d，Rel基因在各组织表达量无显著性变化。ERK于感染病毒后36 h，在哈德氏腺中基因表达量显著下调(P<0.05)；感染后72 h，在脾脏、法氏囊和盲肠扁桃体中基因表达量显著下调(P<0.05)；感染后7 d，基因表达量无显著性变化；感染后21 d，在法氏囊和盲肠扁桃体中表达量显著下调(P<0.05)(图3)。

图2 感染FAdV-4后各组织TLR1基因表达水平变化 A．TLR1;B.TLR2;C.TLFR3;D.TLR5;E.TLR7;F.TLR15

图3 感染FAdV-4后各组织TLRs信号通路关键基因表达水平变化 A.MyD88基因;B.TRIF基因;C.Rel基因;D.ERK基因

2.4 FAdV-4感染后AvBDs基因在鹅组织中的表达量鹅经FAdV-4感染后不同时间和组织器官中，AvBDs基因表达量存在明显差异。AvBD1,4,7,9,10在试验时间内部分组织中未检测到，AvBD2,5,16在不同时间的各组织中广泛分布，AvBD6未检测到(部分结果图中未显示)。试验期间，与对照组相比，AvBD1在感染前期(36和72 h)法氏囊中被诱导表达(P<0.05)。AvBD2在不同时间点的不同组织中广泛表达，在骨髓中的表达量高于其他组织。AvBD4仅在骨髓、法氏囊和盲肠扁桃体中检测到，但其表达量均无显著性变化。AvBD5在FAdV-4感染后36 h、7和21 d的脾脏中基因表达被完全抑制(P<0.05)，在病毒感染期间骨髓中相对表达量有上调趋势但差异不显著。AvBD7在试验期间骨髓、法氏囊以及感染前期哈德氏腺中检测到，但其基因相对表达量无显著性变化。AvBD9仅在脾脏(36 h)中被诱导表达(P<0.05)。AvBD10在骨髓、法氏囊(7 d)中基因相对表达量显著上调(P<0.05)。AvBD16在脾脏(36 h)中基因相对表达量显著上调(P<0.05)，且整个试验过程中AvBD16在骨髓和法氏囊中的基因相对表达量高于其他组织(图4)。

图4 感染FAdV-4后AvBDs基因在各组织表达水平变化 A.AvBD1;B.AvBD5;C.AvBD10;D.AvBD16

2.5 FAdV-4感染后细胞因子基因在鹅组织中的表达量经FAdV-4感染后，白细胞介素在不同时间和不同组织器官中分布广泛，基因表达量存在明显差异。感染FAdV-4后36 h，IL-1β在法氏囊、盲肠扁桃体中表达量显著下调(P<0.05)；IL-2在哈德氏腺、法氏囊中基因表达明显受到抑制(P<0.05)；IL-6在盲肠扁桃体中基因表达量显著上调(P<0.05)，而在脾脏中基因表达量显著下调(P<0.05)；IL-8和IL-18未发现显著性变化。感染FAdV-4后72 h，IL-1β在骨髓中基因表达受到抑制(P<0.05)；IL-2在法氏囊中基因表达量显著下调(P<0.05)；IL-8在脾脏中基因表达量显著上调(P<0.05)；IL-18在脾脏中受到诱导表达(P<0.05)。感染FAdV-4后7 d，IL-1β和IL-2在法氏囊中基因表达量显著下调(P<0.05)；IL-6、IL-8和IL-18无显著性变化。感染FAdV-4后21 d，IL-1β除在盲肠扁桃体中基因表达量显著上调以外(P<0.05)，在哈德氏腺、骨髓和法氏囊中基因表达量均显著下调(P<0.05)；IL-2在哈德氏腺中基因表达量显著上调(P<0.05)，而在法氏囊中受到抑制(P<0.05)；IL-6在法氏囊和哈德氏腺中基因表达受到抑制(P<0.05)，IL-8在法氏囊中表达量显著下调(P<0.05)。感染FAdV-4后，IFN-γ基因未在哈德氏腺表达，与对照组相比，在整个试验期间法氏囊中，IFN-γ基因表达量均表现出下降趋势，且在感染后21 d，表达量显著下调(P<0.05)(图5).

3 讨论

2015年以来，FAdV-4在中国鸡群中流行，严重影响家禽生产性能，研究发现，FAdV-4感染可以导致鸡只死亡率70%[20]，鸭死亡率15%[21]，给养禽业发展造成严重影响。LI等[23]用本试验所用毒株感染40日龄SPF鸡，肌肉注射组发病率100%和死亡率90%，口腔攻毒组发病率100%和死亡率30%，病毒感染后，肝脏出现脂肪空泡、坏死灶和核内包涵体，心外膜水肿[13]。研究发现，对鹅进行人工感染FAdV-4时，皮下注射组有3只鹅出现抑郁和瘫痪的症状，并且有1只鹅死于轻度心包，而口腔感染组未出现明显的发病和死亡情况[22]。本次试验中，鹅感染FAdV-4后没有明显的发病症状和死亡现象，剖检时没有典型眼观病变。推测可能HN/151025株具有物种差异性，该毒株对鹅易感性较差。LI等[23]研究发现，鸡只感染FAdV-4后，可以在多种组织中检测到较高的病毒载量，但是该病毒不感染鸭。然而，本试验发现，经鸡源FAdV-4强毒-HN/151025株感染鹅后，在脾脏和骨髓中并未检测到病毒，在感染前期的法氏囊，以及感染后期的盲肠扁桃体和哈德氏腺中检测到病毒，且在大肠胰腺和胆囊不同时间点均检测到较高的病毒载量，推测可能由于HN/151025株在鹅体内组织嗜性发生改变，易感性较差，以及AvBDs、ILs和IFN等免疫相关因子的表达抑制病毒在鹅体内的复制等原因造成的。

TLRs在先天免疫中发挥重要作用，目前，多项研究表明，TLRs参与AIV、IBDV、IBV和沙门菌等病原体的抗感染机制，可以诱导抗病毒因子表达，保护机体免受病原体的侵袭[24-25]。然而，对于禽TLR在FAdV感染中的作用研究较少。本次试验表明，在感染初期，TLR2和TLR3在脾脏中相对表达量上调(P<0.05)；在感染后期，TLR5和TLR15在个别组织中表达量上调(P<0.05)。有研究发现，TLR2和TLR3可以识别dsDNA病毒[26-27]，这与本试验结果一致。有研究表明，DNA病毒马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)在感染鸡后，法式囊和脾脏中TLR3、TLR7以及TLR15的表达量上调[28]。本次试验中TLR7并未被诱导表达，反而在部分组织中表达量显著下调(P<0.05)。有研究发现，TLR7仅可以识别单链RNA病毒，当病毒进入到受感染细胞的细胞质中时，才能被TLR7识别[29]。ZHOU等[30]通过体内试验证实，MyD88参与了哺乳动物腺病毒感染所引发的TLRs信号传导途径以及诱导产生炎症细胞因子。在禽体内，除TLR3外的TLRs均能经MyD88途径最终导致核因子NF-κB激活，而TLR3必须与TRIF接头蛋白结合才能激活下游通路，诱发炎症反应。MyD88仅在感染后36 h显著上调(P<0.05)，与TLR2的表达情况一致；而与TLR3的表达情况不同的是，TRIF在感染初期表达量受到抑制，而感染后期表达量显著上调(P<0.05)。因此，推测腺病毒感染鹅后可能由TLR2识别病毒，通过NF-κB途径而引起下游信号级联反应。

TLRs与特异性配体相互作用可以诱导防御素和细胞因子等表达，防御素是先天免疫重要的组成部分，目前，在禽类体内发现了50多种AvBDs，AvBDs最开始被认为是抗菌剂，近几年研究发现其具有抗病毒的潜力。研究表明，AvBDs对鸭肝炎病毒[31]、流感病毒[32]和传染性支气管炎病毒[33]具有抗病毒活性。研究发现，鸡感染NDV后能够诱导AvBD2以及AvBD5基因表达[34]；经鸭源ND强毒感染后，鸭体内AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD9和AvBD16的表达量显著升高[35]；而鹅感染NDV后，AvBD4和AvBD16能够被诱导表达，在感染前期的盲肠扁桃体中，AvBD1的表达受到抑制[18]。在感染鸭肝炎病毒的鸭组织中AvBD1表达量上调[31]，然而本次试验发现，经FAdV-4感染后，鹅体内AvBD1、AvBD9、AvBD10和AvBD16表达量上调，AvBD5表达量受到抑制。这些发现表明，病毒对AvBDs表达量的影响可能取决于病毒的种类、动物的种类或者不同的组织器官。

细胞因子在抗病毒反应和调节免疫应答中发挥重要作用，IL-1β可以通过诱导促炎基因表达和募集免疫细胞介导炎症反应，进而发挥抗病毒感染的作用[36]。PAMPs不能直接影响IFN-γ的表达，激活的巨噬细胞分泌的IL-2、IL-18可以调节IFN-γ的表达[37]。LI等[23]研究发现，感染FAdV-4的鸡只，组织中IL-6和IL-8基因表达量显著上调，引起严重的炎症反应，造成鸡只急性死亡。本研究发现，感染前期，鹅组织中IL-6和IL-8基因表达量显著上调，感染后期，IL-6和IL-8基因表达量受到抑制，说明，FAdV-4感染存在较大的种间差异。研究发现，肉鸭皮下注射和口服感染FAdV-4后，IL-2表达量显著上调，分别在6和9 d达到最大值，而后表达量显著下调[38]。与之不同的是，本试验中经滴鼻点眼感染FAdV-4后，IL-2表达量显著下调，21 d表达量显著上调，这可能与种间差异和感染途径有关。HELENA等[39]发现鸡感染FAdV-4后，IFN-γ水平下降，并且在10 d显著下调。本试验结果与之相似，IFN-γ感染前期均显示下降趋势，且在21 d显著下调。

本次研究发现，鸡源FAdV-4强毒-HN/151025株可以感染鹅群，但是并不引起明显的发病率和死亡率，说明FAdV-4感染存在较大的种间差异。此外，FAdV-4感染诱导大量先天免疫相关基因(TLR2、AvBD1、AvBD9、AvBD10、AvBD16、IL-6和IL-8)表达，这些因子可能在鹅抗FAdV-4感染的先天免疫中发挥作用，为预防FAdV感染和疫苗佐剂的研发提供新的可能。