基于改进移动窗口目标转化因子分析的多农药残留自动化定性分析方法

杨清华，李尚科，刘霞，蒋立文，李跑，2，*

（1.湖南农业大学食品科学与技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；2.湖南省农业科学院湖南省农产品加工研究所，湖南长沙410125）

随着人民生活水平的不断提高，食品安全越来越受到关注，尤其是果蔬中多农药残留问题是关注的焦点[1-2]。食品中多农药残留的危害极大，轻则引起食物中毒，严重可导致癌症、胎儿畸形等[3-5]。目前最常见的农药残留检测方法有气相色谱法（gas chromatography，GC）[6]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]、液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）[9]等。色谱法灵敏度高，但易受基质的影响；色谱联用技术在质谱的帮助下能使组分的定性更加快速和可靠，然而依旧较难实现对复杂基质样品中多农药残留的快速自动化定性分析。此外，现如今大多数检测方法仅仅是对样品中已知存在的农药进行检测。Li等[10]建立一种蔬菜中三唑类杀菌剂（triazole fungicides，TFs）的磁固相萃取-气相色谱-火焰离子化检测器（magnetic solid phase extraction-gas chromatographyflame ionization detector，MSPE-GC-FID）检测方法，该方法对5种TFs都有良好的线性范围。然而此方法中磁性多孔有机聚合物的合成要经过偶氮反应，对萃取时间、pH值、离子强度、吸附剂用量、样品体积和洗脱液进行优化后才能实现TFs的准确分析，该方法步骤繁琐，操作复杂，不适合多组分样品的分析。张秀丰等[11]采用改进快速样品前处理技术为前处理方法，利用GCMS仪器实现对茶叶中毒死蜱、联苯菊酯等农药残留的检测，结果在0.01 mg/L～3.00 mg/L显示出良好的线性关系，此方法GC-MS检测消耗时间长，也不适合多组分快速无损检测。

由于食品中样品基质的复杂性，在分析信号中易出现色谱峰重叠以及噪声干扰等现象，导致样品中农药残留无法准确检测，而化学计量学对复杂信号中组分信号的提取以及背景噪声的扣除都有着非常好的作用[12-16]。化学计量学自动化解析可以缩短试验时间、减少有毒有害试剂的使用，还可以对多种农药进行同时检测，从而实现样品中农药残留的快速定性分析。如今已发展了较多的化学计量学方法如化学因子分析的一系列算法[17]以及连续小波变换算法[18]等。Wu等[19]采用非负免疫算法（non-negative immune algorithm，NNIA）对韭菜的GC-MS数据进行解析，可以实现韭菜中扑草净的快速检测。NNIA算法适合对样品中的特定组分解析[20]，但较难实现复杂体系中多农药残留分析。本课题组[21]采用移动窗口目标转化因子分析算法（moving window target transfer factor analysis method，MWTTFA），9 min内可得到36种农药残留信息。然而MWTTFA对更为复杂的多组分样品进行解析时，往往出现误判的情况，无法得到准确的定性结果。为此，本文提出了改进移动窗口目标转化因子算法（improved movingwindowtargettransferfactoranalysis，IMWTTFA），并对混合农药标准品进行自动化定性分析，并将标准洗脱和快速洗脱条件下的结果进行比较与分析，以期实现对多农药组分的快速定性分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

QP 2010气相色谱-质谱仪：日本岛津仪器公司。

氟乐灵、克百威、阿特拉津、西玛津、六氯苯、抗蚜威、扑草净、甲基对硫磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、三唑酮、二氯丙酸、喹硫磷、腐霉利、杀扑磷、苯线磷、4，4-滴滴滴、β-硫丹、三氯杀螨醇、敌菌丹、甲氰菊酯、三氯杀螨砜、伏杀磷、双甲脒、氯菊酯、氯菊酯反式、氯氰菊酯、甲胺磷、乙酰甲胺磷、仲丁威、残杀威、氧化乐、2-氯氰菊酯、丁酰肼、α-硫丹、乙硫磷、氰戊菊酯、异丙威、喹硫磷：天津阿尔塔科技有限公司。

1.2 色谱、质谱条件

色谱质谱条件参照农业部标准NY 1380-2007《蔬菜、水果中51种农药多残留的测定气相色谱-质谱法》[22]：GC-MS分析仪型号为QP2010 Ultra（日本岛津），色谱柱CP-Sil8CB由美国VARIAN公司提供，规格为30 m×0.32 mm×0.25 μm；进样口的温度设置为250℃，进样方式为不分流进样。标准洗脱程序升温操作：95℃保持1.5 min，以20℃/min升温至190℃，5℃/min升温至230℃，25℃/min升温至290℃保持20 min。快速洗脱程序升温操作：以60℃保持2 min，以80℃/min升温至260℃，保持6 min；载气为He（纯度≥99.999%），进样量为 2 μL，流速为 1.2 mL/min。电子轰击源（EI）作为离子源，其温度设置为230℃，传输线的温度设置为280℃，电压设置为70 eV。

1.3 试验方法

本文在原有MWTTFA[21]的基础上，根据检测的实际条件对阈值进行调整并增加对匹配区域内保留时间谱峰的检验。IMWTTFA的计算有以下3个步骤：

1）收集常见240种农药的质谱数据，所有的质谱图均为标准化质谱图，创建240种农药的标准质谱库。

2）以240种农药标准质谱为输入值，采用IMWTTFA对标准洗脱和快速洗脱条件下数据进行计算，由于在标准洗脱和快速洗脱试验中得到的质谱与质谱库中的标准质谱存在一定的差异，匹配度的阈值降低为60%，筛选出高于阈值的结果，若在较短的洗脱时间内存在明显的高于阈值（60%）匹配区域，则初步判定该农药组分存在。

3）根据第二步筛选的结果与色谱（总离子色谱流图）的保留时间进行对比，如果色谱峰在此保留时间区域存在，则说明此农药组分存在。

2 结果与讨论

2.1 标准洗脱与快速洗脱条件色谱图分析

按照农业部标准NY1380-2007《蔬菜、水果中51种农药多残留的测定气相色谱-质谱法》[22]的色谱条件对多农药残留样品进行检测。此外，为实现对农药残留的快速检测，采用缩减时间后的快速洗脱程序升温对样品进行检测。农药混合标准品的总离子色谱图见图1。

图1色谱图中（a）为标准洗脱条件的总离子流图（35 min），（b）为快速洗脱条件总离子流图（9 min）。数据点间隔均为0.47 s。图1（a）中从5 min开始出峰，当9 min时谱峰比较集中；图1（b）中从4 min开始出峰，谱峰集中在4 min～7 min。从总离子流图中可知，存在较多的谱峰重叠与背景干扰，因此较难实现样品中多农药残留的定性分析。

图1 农药混合标准品的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatography of standard pesticide mixtures

2.2 改进移动目标转化因子解析结果分析

标准洗脱与快速洗脱程序解析结果对比见图2～图4。

以240种农药标准质谱为输入值，采用IMWTTFA对标准洗脱和快速洗脱条件下数据进行计算，经过第二步筛选后得到了标准洗脱条件下为63种可能农药组分，快速洗脱条件下为47种可能农药组分。以甲拌磷结果为例，图2（a）为标准洗脱条件下甲拌磷匹配度图；图2（b）为快速洗脱条件下甲拌磷匹配度图。

图2 甲拌磷匹配曲线图Fig.2 Matching curves of phorate

从图2（a）可知当保留时间在9.076 min～9.262 min时，甲拌磷的匹配度超过60%且与总离子流图中的保留时间进行匹配存在色谱峰，初步判断甲拌磷农药存在该样品中。从图2（b）可知当保留时间在4.428 min～4.561 min时，甲拌磷的匹配度超过60%且与总离子流图中的保留时间进行匹配也存在色谱峰，初步判断甲拌磷农药存在该样品中。

图3为标准洗脱条件下敌乐胺匹配度曲线图。

图3 标准洗脱敌乐胺匹配度曲线图Fig.3 The matching curve of standard elution dipyrolamine

由图3可知，虽然整个洗脱时间内存在高于60%的匹配区域，但是并未在较短的洗脱时间内存在明显高于阈值的匹配度区间。因此根据第二步筛选原则可判断敌乐胺农药不存在该样品中。

图4为快速洗脱条件下β-硫丹匹配度曲线图。

图4 快速洗脱β-硫丹匹配度曲线图与多农药残留样品的总离子流图Fig.4 Matching curve of rapid elution of beta-endosulfan and total ion flow chromatogram of standard elution of multi-pesticides

从图4可知，根据1.3中2）筛选原则保留时间在5.778 min～5.826 min时，此区域存在明显高于阈值的匹配度；然而根据1.3中3）筛选原则将此区域与色谱图总离子流的保留时间进行对比，发现色谱图上并不存在谱峰，由此可判断β-硫丹不存在该样品中。

2.3 定性结果分析

本试验将标准洗脱和快速洗脱条件下的结果进行比较与分析，以期实现对多农药组分的快速定性分析。表1为多农药残留样品在标准洗脱条件下各组分的中英文、CAS号、保留时间和匹配度。经IMWTTFA检测到51种农药组分。

由表 1 可知，β-硫丹、α-硫丹、双甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、残杀威-2、氰戊菊酯-2、异丙威-2、2-氯氰菊酯-2此11种农药仅存在于标准洗脱条件中。

表1 标准洗脱条件下各组分保留时间和匹配度数据表Table 1 Retention time and matching data of standard elution

续表1 标准洗脱条件下各组分保留时间和匹配度数据表Continue table 1 Retention time and matching data of standard elution

表2为多农药残留样品在快速洗脱条件下各组分详细的保留时间和匹配度。经IMWTTFA检测到44种农药组分。

表2 快速洗脱条件下各组分保留时间和匹配度数据表Table 2 Retention time and matching data of rapid elution

由表2可知，三氯杀螨醇-2、敌菌丹-2、丁酰肼-2此3种农药仅存在于快速洗脱条件中。双甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、残杀威-2、氰戊菊酯-2、异丙威-2、三氯杀螨醇-2、敌菌丹-2、丁酰肼-2、2-氯氰菊酯-2这12种农药与双甲脒-1、氯菊酯-1、氯菊酯反式-1、氯氰菊酯-1、仲丁威-1、残杀威-1、氰戊菊酯-1、异丙威-1、三氯杀螨醇-1、敌菌丹-1、丁酰肼-1、2-氯氰菊酯的质谱相似，引起这种差异的结果可能是快速洗脱条件下的总离子流受样品基质影响严重，导致农药组分特别是同分异构体组分的谱峰被掩盖。

2.4 改进移动目标转化因子分析与移动目标窗口转化因子分析方法结果的对比

按照已有文献[23-24]将阈值调整为60%后，经IMWTTFA进行解析，标准洗脱条件第二步筛选农药为65种农药，快速洗脱条件第二步筛选农药为47种农药。标准洗脱条件下的敌乐胺、赤霉素、丁氟消等14种农药都不存在色谱峰，根据第三步筛选的原则，这14种农药都不存在该多农药残留样品中，所以标准洗脱条件下经三步筛选为51种农药；快速洗脱条件下的β-硫丹、赤霉素、丁酰肼-1此3种农药都不存在色谱峰，根据第三步筛选的原则，这3种农药都不存在该多农药残留样品中，所以快速洗脱条件下经三步筛选为44种农药。然而采用MWTTFA进行自动化检测时，设置的阈值为75%，且只经过第一步和第二步的筛选，并没有进行第三步谱峰检验，所以检测出的多农药残留信息较少。所以本试验利用IMWTTFA计算时，根据试验条件对阈值进行调整，使组分能够被正确检测到；此外IMWTTFA还对计算结果进行了谱峰匹配，降低了试验误判的可能性。

3 结论

本文建立240种常见农药的标准质谱数据库，确定IMWTTFA对GC-MS数据进行自动化解析的筛选步骤。IMWTTFA可以实现多农药残留样品中农药组分的定性分析，且结果表明快速洗脱条件得到的检测结果与标准洗脱条件得到的检测结果基本一致，能够为实际多农药残留检测提供一种有效方法。然而，IMWTTFA虽然能够较大程度得到样品中可能存在的所有农药的残留信息，但遇到同分异构体组分质谱相近的情况时，较难得到所有组分信息，因此还需要对算法进一步改进。