超声辅助纤维素酶法制备杏鲍菇蛋白质工艺优化

许新月，崔文玉，黄泽天，弓志青，王文亮，王延圣，*

（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.聊城市阳谷县农业农村局，山东聊城252300）

杏鲍菇属于伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]，因其营养丰富口感鲜美，具有草原牛肝菌之称[2]。杏鲍菇营养物质丰富，蛋白质、膳食纤维含量较多，脂肪、灰分含量少，是优质的蛋白来源。杏鲍菇蛋白的抗炎性、抗病毒性以及抗氧化性等功能已经得到研究人员证实[3-4]。杏鲍菇蛋白中具有人体必需氨基酸，在进入人体消化系统后生成分子量不同的肽，其中小分子肽对降血压、提高人体免疫力，以及预防癌症等均有良好的功效，已逐渐成为研究热点[5-6]。现已有研究人员对杏鲍菇蛋白的提取方式进行了研究，本文在已有研究的基础上将超声与纤维素酶解的方式结合在一起，通过响应面分析进一步优化杏鲍菇蛋白提取方式，显著提高了提取率，为下一步杏鲍菇蛋白功能活性研究奠定了基础[7-10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂

杏鲍菇：济南华联超市；考马斯亮蓝G-250染料试剂、牛血清蛋白标准品：美国Sigma公司；纤维素酶（400 U/mg）：上海源叶有限公司；氢氧化钠（片状）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：莱阳经济技术开发区精细化工厂。

1.1.2 仪器与设备

SHZ-A水浴恒温振荡器：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；SB25-12DTb超声水浴锅、SCIENTZ-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；AR423CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；CR22GⅢ高速冷冻离心机：日本日立（HITACHI）公司；SG2便携式pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-6100型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；78HW-1型恒温磁力搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造公司。

1.2 试验方法

1.2.1 杏鲍菇粉末的制备

将杏鲍菇清洗后切片，放入50℃电热鼓风干燥箱中烘干，使用高速粉碎机打粉后过100目筛，置于干燥器中保存。

1.2.2 杏鲍菇蛋白的提取

取定量杏鲍菇干粉，按照试验设计选取料液比、时间、温度、pH值，杏鲍菇粉末水提一定时间后8000r/min离心10min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2.3 牛血清蛋白标准曲线绘制

称取29.25 g NaCl固体溶于500 mL去离子水中，配置成0.15 mol/L NaCl溶液，0.1 g牛血清蛋白溶于1 000 mL去离子水中配置成100 μg/mL的标准蛋白溶液[11]。取 7 个干净的试管编号 0、1、2、3、4、5、6，向每只试管中分别加入 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 的标准蛋白溶液后，每只试管中分别加入 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL的NaCl溶液，再分别加入5 mL的考马斯亮蓝G-250溶液[12-13]，混匀后静置5 min，以0号试管作为空白对照，于595 nm处测定吸光值。得出线性方程为y=0.008 8x+0.008 3，相关系数R2=0.998 8。

1.2.4 指标的测定

杏鲍菇总蛋白含量采用凯氏定氮法测定；上清液中蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；杏鲍菇蛋白提取率的计算：蛋白提取率/%=（上清液中蛋白含量/杏鲍菇总蛋白含量）×100[12]。

1.2.5 单因素试验设计

1.2.5.1 料液比对蛋白提取率的影响

杏鲍菇粉1 g，超声功率300 W，超声20 min，研究1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响[14-17]。

1.2.5.2 超声功率对蛋白提取率影响

杏鲍菇粉 1 g，料液比 1∶30（g/mL），超声功率分别为 100、200、300、400、500 W，超声 20 min。

1.2.5.3 超声时间对蛋白提取率得影响

杏鲍菇粉 1 g，料液比 1 ∶30（g/mL），超声功率400 W，分别超声 10、15、20、25、30 min。

1.2.5.4 纤维素酶酶解时间对蛋白提取率的影响

向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，pH 7.0，酶解温度 20 ℃，分别酶解 25、30、35、40、45 min。

1.2.5.5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响

向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，酶解温度20℃，酶解时间30 min，酶解pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。

1.2.5.6 纤维素酶酶解温度对蛋白提取率的影响

向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，酶解pH 7.0，酶解时间30 min，酶解温度25、30、35、40、45、50 ℃。

1.2.5.7 纤维素酶添加量对蛋白提取率的影响

纤维素酶酶解pH 7.0，酶解时间30 min，酶解温度20℃，纤维素酶添加量为杏鲍菇粉质量的1%、2%、3%、4%、5%[18-20]。

1.2.6 响应面试验设计

在单因素试验基础上，选取具有显著影响的功率（A）、时间（B）、料液比（C）、纤维素酶添加量（D）为自变量，杏鲍菇蛋白提取率为响应值（Y），使用Design-Expert 8.0.5b软件Box-Behnken中心组和试验设计原理，进行四因素三水平响应面分析，建立杏鲍菇蛋白提取率的二次多项式数学模型[21-22]。试验因素及编码水平见表1。

表1 试验因素与水平表Table 1 Experimental factors and level table

1.3 数据分析

使用Excel和Design-Expert 8.0.5b进行数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇蛋白提取率影响因素的研究

2.1.1 料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响

不同料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响见图1。

图1 料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析图1得出，随着液体体积增大，蛋白提取率增加，在料液比1∶30（g/mL）时提取率最大，此后随液体体积的增大蛋白提取率呈下降趋势。在液体体积较低时杏鲍菇粉扩散作用较弱，蛋白提取率低；当液体体积较高时，蛋白与溶液之间的浓度差较小不利于蛋白溶出。因此选择料液比1∶30（g/mL）进行下一步试验。

2.1.2 超声功率对蛋白提取率的影响

不同超声功率对蛋白提取率的影响试验结果见图2。

分析图2得出，杏鲍菇蛋白提取率在100 W～400 W范围内，随超声功率的提高逐渐增大，在超声功率400W时达到最大，此后超声功率提高，蛋白提取率下降。在随着超声功率增大的过程中，超声破碎杏鲍菇的细胞壁使其细胞中的蛋白溶出，蛋白提取率增加；超声功率继续增大，超声破坏已溶出的蛋白质，蛋白提取率降低。

2.1.3 超声时间对蛋白提取率的影响

不同超声时间对蛋白提取率的影响试验结果如图3所示。

图2 超声功率对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

图3 超声时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在10 min～20 min范围内，随着超声时间的延长，蛋白提取率增大，在20 min时达到最大，随着时间继续增加，蛋白提取率降低。超声前期杏鲍菇细胞破碎蛋白溶出，提取率升高；后期超声过程中，破碎已溶出的蛋白，同时超声时间过长产生热量对蛋白具有破坏作用，故提取率降低。

2.1.4 纤维素酶酶解时间对蛋白提取率的影响

不同纤维素酶酶解时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图4所示。

图4 纤维素酶酶解时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of cellulase hydrolysis time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在25 min～35 min范围内，随着酶解时间的增加，蛋白提取率增大，在35 min时达到最大，随后呈现下降的趋势。随着时间继续增加，纤维素酶进一步对破碎后的杏鲍菇细胞壁进行水解，蛋白质溶出，提取率升高；时间增加，凝集沉淀，提取率降低。

2.1.5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响

不同纤维素酶酶解pH值对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图5所示。

图5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of cellulase hydrolysis pH value on protein extraction rate

pH 4.0时，杏鲍菇蛋白提取率最低，因为该pH值位于杏鲍菇等电点附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低。pH 6.0时蛋白提取率最高，此时纤维素酶活性最大，蛋白质-水相互作用增强，溶解性提高；此后，随pH值增大，纤维素酶活性降低，提取率降低。

2.1.6 纤维素酶酶解温度对蛋白提取率的影响

不同纤维素酶酶解温度对蛋白提取率影响试验结果如图6所示。

图6 纤维素酶酶解温度对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of cellulase hydrolysis temperature on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析图6可以看出，杏鲍菇蛋白提取率呈现先升高后下降趋势，温度30℃时，提取率最高，纤维素酶活性最大；温度继续升高，纤维素酶活性下降，杏鲍菇蛋白受热分解，提取率下降。

2.1.7 纤维素酶添加量对蛋白提取率的影响

不同的纤维素酶添加量对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图7所示。

图7 纤维素酶添加量对杏鲍菇蛋白提取率的影响Fig.7 Effect of cellulase addition on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

随着纤维素酶添加量的增加，蛋白提取率呈现先升高后下降的趋势，在添加量为2%时蛋白提取率最高，在一定的料液比情况下随纤维素酶增加蛋白提取率升高，纤维素酶添加量增大，总固形物含量上升，杏鲍菇粉扩散作用减弱，同时纤维素酶扩散作用降低，蛋白提取率降低。

2.2 响应面试验设计分析与提取工艺优化

2.2.1 二次回归方程模型的建立

固定纤维素酶酶解时间35 min，纤维素酶酶解pH 6.0，纤维素酶酶解温度30℃，以有显著影响的功率、时间、料液比、纤维素酶添加量为自变量，杏鲍菇蛋白提取率为响应值，试验设计与试验结果见表2[8，21-23]。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 Response surface experiment design and results

采用Design-Expert 8.0.5b数据分析软件进行试验结果的回归分析，得到关于蛋白提取率（Y）以及A、B、C、D 的回归模型：Y=37.04-0.067A-1.34B+2.77C-0.81D-0.15AB+2.12AC+0.92AD+3.27BC+0.45BD+1.60CD-3.22A2-2.03B2-5.44C2-3.75D2。

回归模型方差分析如表3所示。

该模型F=21.56，P<0.001，显示为杏鲍菇蛋白提取效果回归模型极显著；回归方程失拟项的F值为0.17表明失拟项与误差项相比效果不明显；决定系数R2=0.955 7，显示出此模型的拟合程度较好，能够使用该模型对杏鲍菇蛋白提取进行预测分析。

2.2.2 交互作用分析

在该模型A、B、C、D 4个因素中C因素效果极显著，B、D因素效果显著，A不显著；交互作用中，AB、AD、BD交互作用不显著，AC、CD交互作用显著，BC交互作用极显著；在二次项中A2、C2、D2效果极显著，B2效果显著；由F检验可以看出A、B、C、D四个因素对蛋白提取率的影响为C>B>D>A，即料液比>超声时间>纤维素酶添加量>超声功率。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.2.3 响应面分析与优化

各因素交互作用对杏鲍菇蛋白提取率的响应面图见图8。

在图 8（a）～（c）中，响应面图的形状起伏越大，两个因素之间差异越明显。等高线图中，等高线形状趋近于椭圆形则交互作用明显，若等高线形状趋近于圆形则交互作用不明显。

图8（a）中，当超声时间以及纤维素酶添加量一定时，随超声功率以及料液比的变化，蛋白质提取率整体呈现先升高后下降的趋势，料液比变化幅度大于超声功率，提取率最高为35.7%。等高线图呈现椭圆形，交互作用显著。

图8 各因素交互作用对杏鲍菇蛋白提取率的响应面图Fig.8 Response surface diagram of the interaction of various factors on the protein extraction rate of Pleurotus eryngii

图8（b）中，当超声功率与纤维素酶添加量一定时，随着超声时间与料液比的变化，蛋白提取率整体变化明显，响应面图中随着超声时间的变化蛋白提取率变化明显，先升高后下降的趋势明显，料液比变化幅度大于超声时间，提取率最高为36.7%。等高线图中呈现椭圆形，超声时间与料液比的交互作用极显著。

图8（c）中，当超声时间与超声功率一定时，随着料液比和纤维素酶添加量的变化，响应面图蛋白提取率整体变化明显，料液比变化幅度大于纤维素酶添加量，提取率最高为35.4%。等高线图呈现椭圆形，交互作用显著。

2.2.4 回归模型验证

Design-Expert 8.0.5b分析结果表明，最佳料液比为1∶30.31（g/mL）、超声功率398.7 W、超声时间 20.4 min、纤维素酶添加量1.92%。杏鲍菇蛋白提取率理论值为75.1%。根据实际修正为料液比1∶30（g/mL）、超声功率400 W、超声时间20 min、纤维素酶添加量2%，得到的杏鲍菇蛋白提取率为75.7%，相对偏差0.79%，可见该模型能够较好预测蛋白提取条件。

3 结论

对杏鲍菇蛋白提取的研究，从料液比、超声功率、超声时间、纤维素酶酶解时间、纤维素酶酶解pH值、纤维素酶酶解温度、纤维素酶添加量7个方面对杏鲍菇蛋白提取影响因素进行了研究，选取了4个具有显著影响效果的因素进行响应面分析，由F检验得出对杏鲍菇蛋白提取效果影响顺序为料液比>超声时间>纤维素酶添加量>超声功率。优化后得到最佳提取条件为料液比 1∶30（g/mL）、超声功率 400 W、超声时间 20 min、纤维素酶添加量2%。实际提取率75.7%，理论提取率75.1%，相对偏差0.79%，证明该模型可行，为杏鲍菇蛋白的提取提供了依据。杏鲍菇具有巨大的开发潜力，国内外学者对杏鲍菇的研究较少，因此，为了充分开发利用杏鲍菇，提高杏鲍菇深加工产业的发展仍需加大科研力度，完善杏鲍菇蛋白提取方法，符合工业生产要求，提高生产效率。