下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗后血清miR-342-5p 水平及其意义

杜自忠， 王 晨， 张明星， 靳金龙， 赵 丹， 马书平， 白会玲， 章 立

随着生活方式改变和人口老龄化,下肢动脉硬化闭塞症发病率逐年升高,我国老年人群罹患率为10%左右［1］。 该病是导致下肢截肢的主要原因之一,占所有截肢患者40%～60%［2］。 血管旁路移植手术和介入治疗为目前下肢动脉硬化闭塞症有效治疗方法,但血管旁路手术创伤较大,不适合年龄较大患者,介入治疗具有创伤小、术后恢复快、并发症少等优点,临床上已广泛应用［3］。介入治疗近期疗效较好,但仍有部分患者术后发生再狭窄或需截肢等［4］。因此,早期了解患者预后情况、采取合理干预措施、改善患者预后至关重要。 目前临床上尚缺乏灵敏、准确的生物标记物评估下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后情况。 微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）-342-5p 已证实可通过抑制蛋白激酶B 介导的miR-155 表达参与 动脉粥样硬化过程［5］,但关于miR-342-5p 与下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后的关系未见报道。 为此,本中心开展此项研究,旨在为下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年3 月至2018 年3 月甘肃省中医院救治的195 例下肢动脉硬化闭塞症患者作为研究对象。 根据《下肢动脉硬化闭塞症诊治指南》［6］中的标准进行诊断:①下肢凉、麻木、无力、间歇性跛行和静息痛,肢体缺血性溃疡、坏疽等；②缺血肢体远端动脉搏动减弱或消失；③踝-肱指数＜0.9；④趾-肱指数＜0.7。 患者纳入标准:①下肢血管CTA 显示狭窄程度≥50%；②未接受过对症治疗；③愿接受介入治疗,年龄≥18 岁；④签署知情同意书。 排除标准:①伴有恶性肿瘤； ②术后不能坚持口服抗血小板药物；③有严重肝、肾损害；④既往有下肢损伤史；⑤既往下肢手术史；⑥糖尿病足。195 例患者中男113 例,女92 例；年龄40～72 岁,平均（57.43±4.93）岁；体质指数（BMI）为（27.17±3.09） kg/m2。 本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

抽取患者介入术前及术后12 h 空腹外周静脉血10 mL,室温下4 000 r/min 离心15 min,离心半径8 cm,分离上层血清,置于-20℃冰箱待测。 采用免疫比浊法检测血清C 反应蛋白（CRP）水平（试剂盒购自北京奥维亚生物技术公司）。

采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR）［7］检测患者血清miR-342-5p 相对表达,TRIzol 试剂（美国Thermo公司）提取总RNA,TaqMan microRNA 逆转录试剂盒（美国Thermo 公司）合成cDNA,PCR 扩增。 反应条件为:95℃60 s,95℃15 s,15 s 退火,72℃45 s,40 个循环。以β-肌动蛋白（actin）为内参,采用2-ΔΔCt 表示miR-342-5p 相对表达。 基因序列:miR-342-5p 为F:5'-CCACATTTAAAGGACTGTAT-3',R:5'-AAAAAGCCACATTTAAAGGAC-3'；β-actin 为F:5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3',R:5'-GTCAGTCGCTTGGGCTGT-3'。

介入术后通过电话随访或复诊等方式进行随访（2015 年3 月24 日至2019 年4 月15 日）,记录患者术后12 个月内预后情况。 术后再狭窄、截肢和死亡,定义为预后不良。 下肢彩色超声或CT 复查血管狭窄＞50%,定义为再狭窄［8］。

根据CRP 和miR-342-5p 评估介入治疗预后的最佳截断点,将其转换为二分类变量。 将伴高血压（否=0,是=1）、伴糖尿病（否=0,是=1）、伴高脂血症（否=0,是=1）、伴高同型半胱氨酸血症（否=0,是=1）、吸烟史（否=0,是=1）、泛大西洋学会联盟（TASC）分型（A、B 型=0,C、D 型=1）以及CRP（＜4.27 g/L=0,≥4.27 g/L=1）、miR-342-5p（＜1.23=0,≥1.23=1）作为自变量,预后情况（预后良好=0,预后不良=1）作为因变量纳入logistic 回归分析。

采用二元logistic 回归分析建立介入治疗预后评估模型A（F=-203.934+0.883×伴糖尿病+0.832×伴高脂血症+0.657×吸烟史-0.735×TASC 分型+2.824×CRP）和模型B（F=-204.267+0.832×伴糖尿病+0.810×伴高脂血症+0.837×吸烟史+0.862×TASC 分型+2.911×CRP+5.704×miR-342-5p）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。 服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示,两组间比较用独立样本t 检验,治疗前后比较用配对样本t 检验。 计数资料用卡方检验,以例或率［n（%）］表示。Logistic 回归法分析影响下肢动脉硬化闭塞症患者介入术后复发相关因素。 受试者工作特征曲线（ROC）分析miR-342-5p、模型A、模型B 评估下肢动脉硬化闭塞症患者介入术后复发的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

介入治疗术后195 例患者中预后良好160 例（82.1%,预后良好组）,预后不良35 例（17.9%,预后不良组）,其中25 例（12.8%）发生再狭窄,8 例（4.1%）截肢,2 例（1.0%）死亡。 两组患者间年龄、性别、BMI、伴脑血管病、伴冠心病、伴慢性肾功能不全、病变肢数比较,差异无统计学意义（P＞0.05）；伴高血压、伴糖尿病、伴高脂血症、伴高同型半胱氨酸血症、吸烟史、TASC 分型、CRP 比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,见表1。 两组血清miR-342-5p 相对表达比较,治疗前差异无统计学意义（P＞0.05）,治疗后均降低, 预后良好组降低幅度大于预后不良组,差异有统计学意义（P＜0.05）,见表2。

表1 两组患者基本资料比较

表2 两组介入治疗前后血清miR-342-5p 相对表达比较fmol/L

Logistic 多因素回归分析结果显示, 伴糖尿病、伴高脂血症、吸烟史、TASC 分型、CRP、miR-342-5p与下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后密切相关,见表3。 二元回归分析显示,miR-342-5p 评估介入治疗预后曲线下面积（AUC）与模型A 比较,差异无统计学意义（Z=0.078,P=0.938）；模型B 评估介入治疗预后AUC 高于miR-342-5p 和模型A,差异均有显著统计学意义（Z=2.683,P=0.007；Z=4.624,P＜0.001）,见表4～6,图1。

表3 影响介入治疗预后的多因素分析结果

表4 模型A 预测介入治疗预后的二元分析结果

表5 模型B 预测介入治疗预后二元分析结果

3 讨论

下肢动脉硬化闭塞症由动脉粥样硬化斑块形成引起,若不能及时处理,截肢率较高［9］。 介入治疗为目前临床广泛应用的一种微创手术,虽取得一定疗效,但术后再狭窄或截肢等情况时有发生。 因此,下肢动脉硬化闭塞症患者介入术后预后评估,对改善患者预后具有重要意义。miRNA 是一种非编码单链RNA, 研究显示miRNA 多方面参与动脉粥样硬化进展,如内皮功能障碍、炎性细胞浸润、低密度脂蛋白氧化等［10-12］。 miR-342-5p 在早期巨噬细胞病变中高表达,动物模型和细胞实验均表明miR-342-5p参与动脉粥样硬化发生过程［5］。 本研究旨在探讨miR-342-5p 与下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后的关系。

表6 miR-342-5p、模型A 和模型B 评估介入治疗预后效能

图1 miR-342-5p、模型A 和模型B 评估介入治疗预后的ROC 曲线

本研究显示,介入治疗前下肢动脉硬化闭塞症患者血清miR-342-5p 相对表达高于治疗后, 表明miR-342-5p 可能与下肢动脉硬化闭塞症患者病情存在联系； 预后不良组患者血清miR-342-5p 相对表达高于预后良好组, 表明miR-342-5p 可能与患者预后存在联系。Logistic 回归分析影响下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后因素显示, 伴高血压、伴糖尿病、伴高脂血症、吸烟史、TASC 分型与介入治疗预后密切相关, 该结果与既往研究一致［13-14］；miR-342-5p 与患者介入治疗预后密切相关。

炎性因子介导的动脉粥样硬化与下肢动脉硬化闭塞症发生、发展密切相关［15］。 研究表明,蛋白激酶B 可通过激活核因子κB 上调巨噬细胞过表达一氧化氮合酶-2［16］。 一氧化氮合酶-2 表达升高,促进血管壁中一氧化氮和超氧化物反应生成氧化亚硝酸盐,通过此途径引起高脂蛋白硝化反应及多条代谢信号通路失调,导致代谢产物在血管聚集［17］。 此外,一氧化氮合酶-2 还可引起炎性细胞浸润,通过炎性反应损伤血管内皮, 引起血管内血栓形成［18］。有研究表明, 通过抑制大鼠miR-342-5p 表达可减少一氧化氮合酶-2 介导的过氧亚硝酸盐形成［5］。 因此, 本研究推测miR-342-5p 可能通过促进一氧化氮合酶-2 表达, 参与下肢动脉硬化闭塞症疾病进展。 但关于miR-342-5p 影响下肢动脉硬化闭塞症疾病进展的病理生理机制,仍需进一步探究。

本研究同时应用miR-342-5p、模型A 和模型B评估下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后,结果显示模型B 评估介入治疗预后效能高于miR-342-5p 和模型A, 表明增加miR-342-5p 更有利于下肢动脉硬化闭塞症患者介入治疗预后的评估。

综上所述,miR-342-5p 与介入治疗后下肢动脉硬化闭塞症患者预后密切相关,检测血清miR-342-5p 相对表达有助于评估患者介预后情况。 本研究下一步将动态检测下肢动脉硬化闭塞症患者血清miR-342-5p 相对表达, 并分析miR-342-5p影响下肢动脉硬化闭塞症疾病进展的病理生理机制。