沈 悦, 何 雨, 崔文丽, 朱婷婷, 李宏俊
(亳州学院 中药学院, 安徽 亳州 236800)
生姜是姜科姜属植物,在中国作为传统中药用于治疗伤风感冒、呕吐腹泻、消化不良、关节炎等疾病,为药食两用[1-4]。
近年来,由于生姜具有众多重要的药理作用,受到食品和制药行业的关注。生姜中所含的多种活性成分如黄酮类、姜黄素、姜辣素等具有开胃健脾、抗氧化、杀菌、抑制肿瘤等多种活性[5-8]。
本研究以石油醚为溶剂,索氏提取法萃取,得到生姜油,应用ABTS和DPPH法对姜油进行抗氧化性能研究。
1.1.1 材料
生姜、石油醚(60~90 ℃)、无水乙醇、抗坏血酸、ABTS、DPPH。
1.1.2 仪器
粉碎机、索氏提取装置、旋转蒸发仪、移液枪、ep管、比色皿、紫外分光光度仪。
将生姜用粉碎机研磨成粉,经60目筛过筛,然后用石油醚溶剂进行萃取,再通过旋转蒸发仪减压蒸馏,得到精油。
1.3.1 对ABTS自由基清除能力的测定
1.3.1.1 预实验
1.3.1.1.1 ABTS+·自由基溶液配制
ABTS二铵盐储备液(7.4 mol/L):取ABTS二铵盐6 mg,加蒸馏水1.47 mL(MW=548.7)。
过二硫酸钾(K2S2O8)储备液(2.6 mmol/L):取K2S2O81 mg,加蒸馏水1.43 mL(MW=270.32)。
取1.4 mL ABTS二铵盐储备液和1.4 mL K2S2O8储备液混合,黑暗环境下室温放置12 h,用无水乙醇将混合液稀释10~20倍直至吸光度为0.7±0.02,此溶液即为ABTS+·自由基工作液。
1.3.1.1.2 抗坏血酸清除ABTS+·自由基标准曲线的绘制
1)精密称取抗坏血酸20 mg,用10 mL无水乙醇将其溶解于棕色ep管中,得到2 mg/mL的抗坏血酸标准溶液。
2)取上述2 mg/mL的抗坏血酸标准溶液1 mL于棕色ep管中,加入9 mL无水乙醇,即得到200 μg/mL的抗坏血酸标准溶液。
3)取上述200 μg/mL的抗坏血酸标准溶液1 mL于棕色ep管中,加入3 mL无水乙醇,即得到50 μg/mL的抗坏血酸标准溶液。
4)实验数据见表1,按表所示加入溶液,反应6 min,测量吸光度。
5)清除率计算,
式中:A0----不加样品时的值;
A----加入样品后的值。
6)实验结果数据见表2。
抗坏血酸(50 μg/mL)清除ABTS+·自由基标准曲线如图1所示。
表1 抗坏血酸(50 μg/mL)清除ABTS+·自由基溶液加样
表2 抗坏血酸清除ABTS+·自由基结果数据
1.3.1.2 正式实验
姜油抗氧化活性----ABTS+·自由基清除活性。
1)分别配制0.1、0.5、1.0 mg/mL石油醚部位溶液(同抗坏血酸标准溶液配制方法),ABTS溶液配制同上。
2)实验数据见表3,按表所示加入各溶液,反应6 min后,测量吸光度。
3)清除率计算,
式中:A0----不加样品时的值;
A----加入样品后的值。
4)实验结果数据见表4。
表3 不同浓度姜油清除ABTS+·自由基溶液加样
表4 不同浓度姜油清除ABTS+·自由基溶液结果数据
续表4
不同浓度的姜油提取物清除ABTS+·自由基的标准曲线如图2所示。
图表结合可知,0.5 g/mL姜油所得曲线最佳,清除效果最优。且随着生姜油含量的增大,其清除率也随之增大。
1.3.2 对DPPH自由基清除能力的测定
1.3.2.1 预实验
1.3.2.1.1 DPPH自由基溶液配制
取DPPH固体1 mg溶于10 mL无水乙醇中(避光ep管),超声5 min,充分振荡,混合均匀,并避光保存(5 h内用完)。取1 mL上述DPPH溶液加入适量(每次1 mL)无水乙醇稀释,并测定稀释后的DPPH溶液吸光度,使其吸光度为0.6~1.0之间。若吸光度过大,则继续加溶剂;若吸光度过小,则补加DPPH固体或者原始溶液。
1.3.2.1.2 抗坏血酸清除DPPH自由基标准曲线的绘制
1)精密称取抗坏血酸20 mg,用10 mL无水乙醇将其溶解于棕色ep管中,得到2 mg/mL的抗坏血酸标准溶液。
2)取上述2 mg/mL的抗坏血酸标准溶液1 mL于棕色ep管中,加入9 mL无水乙醇,即得到200 μg/mL的抗坏血酸标准溶液。
3)取上述200 μg/mL的抗坏血酸标准溶液1 mL于棕色ep管中,加入3 mL无水乙醇,即得到50 μg/mL的抗坏血酸标准溶液。
4)实验数据见表5,按表所示加入溶液,反应30 min,测量吸光度。
5)清除率计算,
式中:A0----不加样品时的值;
A----加入样品后的值。
6)实验结果数据见表6。
表5 抗坏血酸(50 μg/mL)清除DPPH自由基加样
表6 抗坏血酸清除DPPH自由基结果数据
抗坏血酸(50 μg/mL)清除DPPH自由基标准曲线如图3所示。
1.3.2.2 正式实验
姜油抗氧化活性----DPPH自由基清除活性。
1)配制5 mg/mL的石油醚部位溶液(同抗坏血酸标准溶液配制方法),DPPH溶液配制同上。
2)实验数据见表7,按表所示加入各溶液,反应30 min后,测量吸光度,计算清除率,并作图。
表7 不同浓度姜油清除DPPH自由基加样
续表7
3)清除率计算,
式中:A0----不加样品时的值;
A----加入样品后的值。
4)实验结果数据见表8。
表8 不同浓度姜油清除DPPH自由基结果数据
不同浓度的姜油提取物清除DPPH自由基标准曲线如图4所示。
图表结合可知,5 g/mL姜油所得曲线最佳,清除效果最优。并且随着生姜油含量的增大,其清除率也随之增大。
0.5 mg/mL姜油提取物清除ABTS自由基的标准曲线如图5所示。
由实验结果可知,0.5 mg/mL姜油的清除效果最好,加入50 μL体积的姜油溶液,清除率便达到50%(IC50);加入300~800 μL体积的姜油溶液时,清除率便接近100%,且保持稳定。
5 mg/mL姜油提取物清除DPPH自由基的标准曲线如图6所示。
由图6可以看出,在加入55 μL体积的姜油溶液时,清除率近至50%(IC50);加入900~1 200 μL体积的姜油溶液时,清除率便接近100%,且保持稳定。
以石油醚为萃取剂,采用索氏提取法对生姜中的成分进行提取,生姜油的提取率为5.45%,分别从ABTS和DPPH两个方面对生姜油的抗氧化性能进行研究,结果表明,不论ABTS法还是DPPH法,随着姜油含量的提高,其抗氧化能力显著提高,然后趋于稳定;随着姜油浓度的提高,其抗氧化能力也有相应提高。