功能性多肽诱导羟基磷灰石仿生矿化的机制研究

凌晨，郭奕群

(1.广东轻工职业技术学院 科研与技术服务处，广东 广州 510300；2.华南理工大学 材料科学与工程学院， 广东 广州 510641)

骨矿化是指无定形的磷酸钙(Ca-P)发展成为结晶态的羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)结晶并埋于骨的有机质间隙中的过程。无定形的Ca-P首先在由胶原纤维形成的三维基质中的空穴区成核，随后沿着胶原纤维向特定的方向生长，最终形成稳定的板状磷灰石晶体[1-2]，如图1所示。板状磷灰石晶体占骨质量的65%，是人体骨骼中的主要无机成分，它能促进缺损组织的修复，显示出生物活性，同时为骨提供优异的机械学性能[3-4]。而溶液中的一些生物分子，如位于骨细胞外基质中的富含酸性和磷酸化氨基酸基团的非胶原蛋白(Non-Collagenous Proteins, NCPs)，会对HAP的成核和生长产生影响，在牙齿及骨骼的矿化过程中起着十分重要的作用[5-6]。研究表明，合成的HAP结合肽(HAP-Binding Apatites, HBPs)，类似于NCPs对HAP表面也具有很高的亲和力，且具有作为生物分子替代物的潜力，影响HAP的矿化[7-8]，如图2所示。因此，确定这些HBPs的结构-活性关系显得尤其必要，能够给应用于骨科和牙科治疗的生物肽的设计提供新的启发。基于此，本研究选择了三种合成肽链(VTK，VTK_7E和pVTK)作为模型HBPs，研究丝氨酸磷酸化、带电氨基酸残基、肽的净电荷对蛋白质二级构象以及HAP成核与晶体生长过程的影响[9]。

图1 骨矿化示意图[2]

1 原材料与实验方法

本研究中所用到的化学试剂包括Ca10(PO4)6(OH)2(HAP，平均粒径小于200 nm)、 CaCl2、(NH4)2HPO4、NaH2PO4·H2O、NaH2PO4、Na2HPO4与HEPES。溶液的溶剂均为超纯水(ρ=18.2MΩ·cm)，实验前用NaOH溶液或盐酸将溶液pH值调节至7.4。

1.1 HBPs序列的设计

VTK由Addison等人通过噬菌体展示技术确定[8]。肽中的酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸残基翻译后的磷酸化是蛋白质或肽链参与调节骨矿化的重要过程[10]。由于VTK包含两个具有磷酸化潜力的丝氨酸(S)残基，因此通过VTK中两个丝氨酸残基的磷酸化获得了另一个模型肽序列pVTK[8]。为了进一步建立肽电荷与其分子行为的关系，设计了一种突变的肽，即采用谷氨酸(E)残基替代VTK的谷氨酰胺(Q)残基，得到了净中性电荷肽VTK_7E(见表1)。以上述三个HBP作为模型序列，探讨HBP潜在的肽结构对活性的影响。

表1 HPBs的氨基酸序列以及净电荷

1.2 HBPs溶液态的制备及其二级结构

将各HBP分别溶于0.1 mM磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中，以获得肽浓度为0.4 mM的溶液，以在后续测试中获得高信噪比的圆二色光谱(Circular Dichroism, CD)。使用1 mm石英样品池收集溶液，以0.1 nm的步长和0.5 nm·s-1的扫描速度在190～300 nm波长范围内进行CD光谱测试，并通过Dichroweb(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)分析从溶液到结合态的二级结构变化百分比。

1.3 HBPs结合态的制备及其二级结构

将30 mg·mL-1的HAP纳米颗粒加入到500 μL浓度为0.4 mM的肽溶液中，置于室温下孵育12 h，得到结合态HBPs。保持步长、扫描速度、波长范围等参数与溶液态HBPs测试一致，对结合态HBPs进行CD光谱表征。

1.4 Ca-P沉淀物的制备及其形态观察

为了确定Ca-P沉淀物的形态转化，在0.1 mM HEPES缓冲液(pH=7.4)中制备25 mM的CaCl2溶液和15 mM的(NH4)2HPO4溶液，并在标准的96孔板上将(NH4)2HPO4溶液缓慢添加到CaCl2溶液进行反应以获得Ca-P沉淀物。随后，将样品置于二氧化碳培养箱中。为了表征不同时刻下Ca-P沉淀物的结构，分别在2 min，10 min，30 min，1 h， 4 h，和6 d时，从每个样品中收集10 μL反应溶液，滴在微栅上置于空气中干燥1 d后用透射电子显微镜(简称TEM)进行分析，并对部分样品使用选择区域电子衍射(简称SAED)以获得样品的详细晶体结构。

2 结果与讨论

2.1 HBPs在溶液态与结合态的二级结构

根据CD光谱分析HBPs在溶液中和结合态的相对二级结构特征，结果如表2。VTK在溶液中呈现41%的α螺旋结构、17%的β折叠和β转角结构及42%的无规卷曲，而当VTK结合到HAP表面上时，其二级结构呈现出67%的α螺旋结构和33%的β折叠和β转角结构。这种从溶液态到结合态的构象变化与VTK肽链中的带电氨基酸基团与HAP表面离子(如Ca2+与PO4-)的结合有关，如图2所示。对于同时具有正负离子的VTK_7E，在溶液态时螺旋结构含量高达91%，与HAP表面结合后，螺旋结构含量降低至37%，而β结构与无规卷曲则相应增加。VTK和VTK_7E从溶液态到结合态的二级结构转变，表明了这些HBPs会发生二级结构类型之间的转变。相比之下，pVTK在溶液中主要表现为无规卷曲，并且在与HAP表面吸附后保持这种构象，这可能是由于无规卷曲具有更好的灵活性，比有序的α、β结构更易使带电残基与表面相互作用，可能更能影响HAP的结晶过程。

图2 HBPs与HAP表面结合示意图

表2 HPBs在溶液态和结合态的二级结构特征

2.2 HBP对于Ca-PO4 晶体成核与生长的调控作用

2.2.1 对照组

从TEM实验结果得知，溶液中的Ca2+和PO4-在两分钟内结合并形成直径约为30～50 nm的球形纳米颗粒，且这些球形纳米颗粒相互连接形成随机网络(图3a)。到10 min时，纳米球逐渐聚集并形成了尺寸约为200～500 nm的颗粒(图3b)。到30 min时，Ca-PO4晶体整体呈现出明显的针状聚集结构，还有少部分板状结构和极少的纳米球(图3c)，与Ca-PO4晶体从无定形纳米球到结晶Ca-P的理论相变过程相吻合。1 h后，纳米球完全消失，主要结构特征为针状结构，并且表现出了更大程度的聚集(图3d)。通过对SAED结果的分析可以确定HAP晶体的(002)、(211)和(004)面，从而确认晶体Ca-P相为HAP(图4a)。纳米球的消失表明大多数或所有无定形相已转变为结晶HAP。从4 h到6 d，针状聚集体持续生长，并出现了一些六角形板状结构(图3e-f)。

图3 对照组中Ca-P沉淀物的形态变化

图4 Ca-P反应1h时的SAED衍射图。

2.2.2 实验组

在VTK，VTK_7E和pVTK存在的情况下，在前两分钟内的Ca-P沉淀物中也观察到的球形纳米颗粒(图5a、图6和图7)。但相比对照组而言，这些纳米球的平均尺寸更大，但数量较少，且没有形成网络结构。由此可以推测HBP的存在抑制了Ca-PO4晶体成核位点的形成。10 min时，所有肽系统中均形成了较大的球形颗粒聚集体(图5b，6b和7b)。 30 min时，在VTK存在下形成的Ca-PO4沉淀物主要表现为针状结构、少部分板状结构和极少的纳米球(图5c)，该形态结构与对照组相似，但相比而言针状结构的聚集体的尺寸更小。当VTK_7E存在时，反应到30 min后就已经观察不到球形纳米颗粒(图6c)，此时Ca-P的形态主要为针状以及板状结构。然而，在pVTK存在的情况下，同一时刻下Ca-PO4沉淀形态结构仍然为无定形颗粒(图7c)。该结果表明，pVTK对于相变的抑制作用更显著。从30 min到1 h，在VTK存在下形成的沉淀已经完全相转化为结晶形式(图5d)；而在VTK_7E存在的情况下，沉淀物的形态特征无明显变化(图6d)；在pVTK存在的情况下，无定形颗粒仍在存在(图7d)。这表明pVTK对Ca-P晶体相变过程具有持续抑制作用。根据SAED图像的衍射环，确定1 h 时VTK和VTK_7E系统HAP的(002)和(211)面(图4b和图4c)，证实了溶液中逐渐形成了结晶型HAP。 但是，在存在VTK的情况下，沉淀物的衍射环更为扩散，意味着Ca-P结晶度较小。pVTK样品未出现衍射环，表明系统中缺乏结晶型HAP(图4d)，与TEM直接观测结果相吻合。随反应时间的增长，VTK和VTK_7E样品中Ca-P形态上没有显着差异(图5e和6e)，但在pVTK系统中首次观察到了针状和薄带状结构，证实了相转变过程的发生。在4 h～6 d之间，VTK，VTK_7E和pVTK系统中的主要析出物形态逐渐发展为小平板状晶体，直至实验周期结束(图5f，6f和7f)。

图5 VTK实验组中Ca-P沉淀物的形态变化

图6 VTK_7E实验组中Ca-P沉淀物的形态变化

图7 pVTK实验组中Ca-P沉淀物的形态变化

3 结论

本研究通过调控HAP成核和生长过程，研究了HBPs特征对其活性的影响。HBPs能抑制Ca-PO4的成核作用，并抑制其向结晶HAP的相转变过程。HBPs通过吸附在特定晶面调节晶体生长方向，最终诱导HAP晶体形成板状结构。此外，磷酸化且净电荷高的pVTK对HAP的成核与生长的影响更为显著，说明磷酸化的肽链更能影响HAP的结晶过程。本文结果表明HBPs类似于生物体内的NCPs，具有调控生物HAP板状晶体成核和生长过程的作用，HBP构效关系的揭示也有助于更深入地探讨生物矿化机理。