乌司他丁联合脂肪干细胞移植对内毒素休克大鼠肾组织的保护作用研究

马涛 梁佳春 师军华

1天津市第五中心医院中西医结合肾内科300450；2天津市滨海新区中医医院急诊科300451

0 引言

目前，内毒素休克已成为重症监护患者死亡的首要原因，其引发的多器官衰竭也成为患者死亡的主要原因[1-2]。医学界对内毒素休克引发的多器官衰竭机制已有多种观点，如炎症的级联放大反应、氧自由基毒性以及血管内活性物质的作用等[3]。肾脏损伤是内毒素休克引发的器官衰竭损伤之一，严重威胁着患者的生命安全[4]。乌司他丁已广泛用于多种危重疾病的治疗，其在内毒素休克引发的肾脏损伤治疗进程中也表现出良好的治疗效果[5]。脂肪干细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）作为一种源于脂肪组织的间充质干细胞，近年来颇受医学研究者的青睐[6]。ADSCs在修复心肌、肝脏等方面疗效显著，在治疗多种器官缺血再灌注损伤方面亦具有较好的效果[7-8]。此外，ADSCs移植对多种肾脏损伤亦具有良好的缓解和治疗作用[9]。本研究拟通过乌司他丁改善机体内环境，ADSCs移植为组织功能修复提供“种子”细胞，探讨乌司他丁与ADSCs移植联合治疗对内毒素休克所致肾脏损伤的保护作用，以期为该病的治疗提供借鉴和依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

胰蛋白酶、脂多糖（美国Sigma公司），DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（美国HyClone公司），TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司），兔抗人Bax、Caspase-3多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。健康清洁级8周龄Sprague-Dawley大鼠108只，雌雄各半，体质量范围200～250 g，购于天津医科大学动物实验室，许可证号SYXK（津）2014-0002。所有Sprague-Dawley大鼠于无特定病原体级环境下分笼饲养，室温（25．0±3．0）℃，相对湿度 60%～70%，自由进食饮水。本研究所有的动物实验均获得天津市动物实验伦理委员会的批准。

HERAcell 150i二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），UVI凝胶成像系统（英国UVItec公司），Thermo Arktik-96孔PCR仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]，Olympus IX71显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的体外复苏培养及CM-Dil标记

将冻存的ADSCs置于37℃恒温水浴箱中30 s快速复苏；待细胞悬液完全融化后，对ADSCs进行洗涤离心，重复此操作3次；用DMEM完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于培养瓶中置于细胞培养箱内培养；待细胞处于对数生长期后，收集细胞，向细胞悬液中加入5 μl CM-Dil，于细胞培养箱中继续孵育25 min，采用显微镜观察细胞形态及CM-Dil标记情况。

1.2.2 内毒素休克模型的建立及分组

从108只健康Sprague-Dawley大鼠中随机选取20只作为正常组，尾静脉注射2 ml氯化钠注射液；剩余88只尾静脉注射2 ml脂多糖（10 mg/kg），建立内毒素休克模型。最终88只大鼠死亡8只，建模成功80只。将这80只模型大鼠随机均分为4个处理组，每组20只。其中模型组大鼠尾静脉注射20 μl氯化钠注射液；ADSCs组大鼠尾静脉注射20 μl浓度为2×107个/L的CM-Dil标记的ADSCs悬液；乌司他丁组大鼠腹腔注射乌司他丁（1×105U/kg）；联合组大鼠腹腔注射乌司他丁（1×105U/kg），并尾静脉注射 20 μl CM-Dil标记的 ADSCs悬液（2×107个/L）。正常组亦尾静脉注射20 μl氯化钠注射液。每天治疗1次，连续治疗3 d。

1.2.3 苏木精-伊红染色观察大鼠肾脏组织的病理变化

干预治疗3 d后，各组随机选取4只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死大鼠，取其左侧肾脏组织；用体积分数为10%的甲醛溶液固定肾脏组织，梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋、切片（厚度为 5～8 μm）；切片脱蜡后进行苏木精-伊红染色，于显微镜下观察大鼠肾脏组织的病理变化。

1.2.4 血清中生化指标测定

干预治疗3 d后，各组随机选取4只大鼠，取尾静脉血。离心提取血清，采用一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）试剂盒分别测定大鼠血清中的NO和NOS含量。

干预治疗3 d后，各组随机选取5只大鼠，采集内眦静脉血，离心收集血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中的肌酐和尿素氮含量。

1.2.5 反转录PCR测定Bax和Caspase-3基因的mRNA表达

干预治疗3 d后，各组随机选取5只大鼠，取双侧肾脏组织于液氮中保存备用。取出50 mg肾脏组织于冰上充分研磨后迅速加入TRIzol试剂裂解细胞抽提总RNA。根据反转录试剂盒说明书合成相应的cDNA并进行扩增。Bax正向引物为5'-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3'，反向引物为5'-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3'，引物长度为 133 bp；Caspase-3正向引物为5'-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3'，反向引物为 5'-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3'，引物长度为148 bp；β-肌动蛋白正向引物为 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反向引物为 5'-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'，引物长度为 444 bp。反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察电泳结果，UVI凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值。以β-肌动蛋白基因为内参，计算Bax、Caspase-3的mRNA相对表达量。

1.2.6 蛋白质印迹法测定Bax和Caspase-3基因的蛋白表达

提取各组双侧肾脏组织的总蛋白并测定蛋白浓度，每组取蛋白40 μg，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（70V、30 min，100 V、90 min）；将凝胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上（200 mA、3 h）；加入质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶，室温封闭2 h；分别加入兔抗人Bax、Caspase-3多克隆抗体（稀释比例为 1∶500），室温孵育 2 h，四聚丙烯（烷基）苯磺酸盐洗涤3次；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体，室温孵育0.5 h，四聚丙烯（烷基）苯磺酸盐洗涤3次，磷酸盐缓冲液洗涤1次；按ECL说明书，将液体A和液体B等体积混合，滴加于膜正面，反应1 min；立即置于暗室中曝光、显影、定影，室温晾干后扫描拍照，分析各蛋白条带灰度值，计算Bax、Caspase-3的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs存活及其CM-Dil标记情况

显微镜下可见复苏培养24 h后，ADSCs开始贴壁并呈现纤维细胞样；48 h后细胞充分伸展为梭形，并逐渐聚集；6 d后开始形成细胞集落（图1A）。CM-Dil标记后荧光显微镜下可见红色荧光阳性细胞（图1B），表明CM-Dil标记成功。

2.2 苏木精-伊红染色

由图2可知，干预治疗3 d后，模型组大鼠肾小球扩张充血，间质中炎症细胞浸润，细胞明显肿胀与空泡变性，胞质深染，偶见坏死病灶；与模型组相比，ADSCs组和乌司他丁组大鼠肾脏损伤明显减轻，联合组大鼠肾脏损伤最轻。

2.3 CM-Dil标记ADSCs在大鼠肾脏组织中的分布情况

图1 显微镜观察脂肪干细胞形态及CM-Dil标记情况（×100）

如图3所示，干预治疗3 d后，正常组、模型组和乌司他丁组大鼠肾脏组织中均未见CM-Dil标记的ADSCs，而ADSCs组和联合组大鼠肾脏组织中可见CM-Dil标记的ADSCs，且联合组CM-Dil标记的ADSCs数量明显多于ADSCs组。

2.4 大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量

由表1可知，干预治疗3 d后，与正常组相比，模型组大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明显升高（均P＜0.05）；与模型组相比，ADSCs组、乌司他丁组和联合组大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明显降低（均P＜0.05），且联合组较ADSCs组和乌司他丁组进一步降低（均P＜0.05）。

2.5 Bax和Caspase-3的mRNA表达

由图4可知，干预治疗3 d后，与正常组相比，模型组大鼠肾脏组织中Bax和Caspase-3的mRNA相对表达量均明显升高（均P＜0.05）；与模型组相比，ADSCs组、乌司他丁组和联合组Bax和Caspase-3的mRNA相对表达量均明显降低（均P＜0.05），且联合组较ADSCs组和乌司他丁组进一步降低（均P＜0.05）。

2.6 Bax和Caspase-3的蛋白表达

由图5可知，干预治疗3 d后，与正常组相比，模型组大鼠肾脏组织中Bax和Caspase-3的蛋白相对表达量均明显升高（均P＜0.05）；与模型组相比，ADSCs组、乌司他丁组和联合组Bax和Caspase-3的蛋白相对表达量均明显降低（均P＜0.05），且联合组较ADSCs组和乌司他丁组进一步降低（均P＜0.05）。

图2 苏木精-伊红染色观察干预治疗3 d后各组大鼠肾脏组织的病理变化（×40）

图3 荧光显微镜观察干预治疗3 d后各组大鼠肾脏组织中CM-Dil标记ADSCs的分布情况（×100）

表1 干预治疗3 d后各组大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量（Mean±SD）

图4 反转录PCR检测干预治疗3 d后各组大鼠肾脏组织中Bax和Caspase-3的mRNA表达

图5 蛋白质印迹法检测干预治疗3 d后各组大鼠肾脏组织中Bax和Caspase-3的蛋白表达

3 讨论与结论

内毒素休克引发的炎症反应、氧化应激及毒性反应等可引起机体多器官衰竭，其中对肾脏损伤尤为严重[4]。肾脏损伤导致肾小管结构及肾脏过滤功能异常，从而引起血液中肌酐、尿素氮等代谢产物含量激增[10]。ADSCs移植可显著缓解肾脏损伤，并改善肾脏的结构和功能[11]。干细胞可旁分泌或内分泌多种免疫调节因子，具有调节免疫、抗凋亡和抗炎症等作用[12-13]。然而目前关于ADSCs移植对挤压伤所致肾脏损伤的疗效研究并不多。乌司他丁可缓解肾脏病理性损伤，抑制炎症反应，缓解肾脏细胞凋亡，从而保护肾脏组织免受损伤[14]。

本研究中模型组大鼠的肾间质内出现炎症细胞浸润，胞质深染，偶见坏死病灶，表明内毒素休克模型建立成功。治疗后与模型组相比，ADSCs组和乌司他丁组大鼠肾脏组织的病理损伤均明显减轻，而联合组肾脏损伤进一步减轻。由此可知，ADSCs移植和乌司他丁干预均可显著缓解内毒素休克所致的肾脏损伤。血清NOS和NO含量升高是机体发生炎症反应的重要指标，而血清肌酐和尿素氮含量升高是肾脏病理变化的临床标志。本研究中与正常组相比，模型组大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明显升高；与模型组相比，ADSCs组、乌司他丁组和联合组血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明显降低，且联合组较ADSCs组和乌司他丁组进一步降低。该结果表明，ADSCs移植和乌司他丁注射可通过缓解炎症反应来减轻肾脏损伤，两者联合可显著改善肾脏功能。此外，ADSCs组和联合组大鼠肾脏组织镜下均可见CM-Dil标记的阳性细胞，且联合组阳性细胞数多于ADSCs组；而正常组、模型组和乌司他丁组肾脏组织中均未见CM-Dil标记的ADSCs，表明乌司他丁可促进ADSCs在机体内的存活和分布。

在调控细胞代谢中，Bax蛋白可激活线粒体通透性转化孔的开放，引起线粒体结构和功能紊乱；而Caspase-3可激活蛋白外流，导致细胞凋亡[15]。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肾脏组织中Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表达均明显升高；与模型组相比，ADSCs组、乌司他丁组和联合组Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表达均明显降低，且联合组较ADSCs组和乌司他丁组进一步降低。上述结果表明，乌司他丁联合ADSCs移植对大鼠内毒素休克所致肾脏损伤具有明显的保护作用，其可能与缓解肾脏细胞损伤有关，这为两者联合用于临床治疗内毒素休克所致肾脏损伤提供了新的思路和方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突