低能量激光疗法对重度牙周炎患者龈沟液中细胞因子的影响

李宏斌 李荣华 赵燕娟

天津市第一中心医院口腔科 300192

0 引 言

牙周炎是牙周组织在菌斑微生物影响下发生的炎症，牙周袋内的微生物可进入血液循环，激活机体免疫反应，使炎症细胞因子大量产生与活化[1]。龈沟液中的白细胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是机体内重要的细胞因子，可有效激活破骨细胞的活性，加速牙槽骨吸收，损伤牙周软组织[2]。可溶性细胞间黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）在牙周炎的发生过程中参与炎症部位的白细胞聚集，促进炎性介质的释放，加重对牙周组织的破坏[3]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是调节细胞外基质合成和降解的重要分子，其中MMP-8可降解弹性蛋白、胶原蛋白、层黏连蛋白活性，通过诱导牙槽骨中的Ⅰ型胶原的降解加重牙周炎患者牙槽骨的吸收[4-5]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 是免疫调节剂因子[6]，可抑制IL-1β的表达，同时拮抗IL-1β引起的炎症反应。低浓度的TGF-β可促进牙周膜细胞生长及胞外基质的合成，有助于炎症的早期愈合[7]。骨膜蛋白是黏附蛋白，在牙周炎的发生、发展中具有参与组织修复、调节细胞增殖和凋亡等作用[8-9]。低能量激光疗法（low-level laser therapy，LLLT)对牙周炎主要起到消炎、抗感染的作用，其可深入手动机械难以到达的牙齿部位如根分叉区，从而激发组织的生长潜力，促进牙周膜细胞的增殖和组织再附着。在牙周炎进展过程中，牙周袋内的细菌会激活宿主抗炎症系统释放蛋白酶、细胞因子等炎性因子，间接损伤牙周组织。近年来，研究者常以龈沟液中细胞因子的水平来评估牙周炎对牙周组织的破坏程度，其也可作为评价牙周炎治疗效果的指标。本研究中，应用LLLT治疗重度牙周炎，检测治疗前、后龈沟液中上述细胞因子的变化，评价LLLT对重度牙周炎的治疗效果，包括对牙周炎症的控制及牙周组织恢复的影响，为临床应用激光治疗重度牙周炎提供支撑。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2018年6月至2019年5月天津市第一中心医院口腔科收治的重度牙周炎患者18例，年龄范围 35～65 岁，年龄（51.7±8.4）岁，其中男性 10例，女性8例[10]。重度牙周炎的诊断标准为：牙周探诊深度（probing depth，PD）≥6 mm；临床附着水平（clinical attachment level，CAL）≥5 mm；影像学资料显示牙槽骨吸收达牙根长的1/2～2/3；磨牙有根分叉病变；患牙多松动；牙周炎症较明显或发生牙周脓肿[11-12]。纳入标准为：患重度牙周炎且有2颗及以上患牙需要拔除；半年内未进行任何牙周治疗；1个月内未使用过抗生素、非甾体类抗炎药物或免疫抑制剂；无吸烟史或戒烟半年以上者；无糖尿病、冠心病、高血压等系统性疾病；依从性好，意愿接受本研究。排除标准为：年龄≤18岁或≥70岁的患者；患系统性疾病（如高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤）；牙周治疗前或治疗期间服用抗生素者；治疗前3个月内服用抗癫痫、抗炎药物者；妊娠期或哺乳期妇女；吸烟者（超过10支/d）；半年内接受过龈下刮治、根面平整等牙周非手术治疗。本研究已通过天津市第一中心医院伦理委员会审查（批号：2018NO77KY），所有入组患者均签署知情同意书。

1.2 主要材料与仪器

细胞因子检测试剂盒（武汉基因美生物公司），酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、Ⅱ型胶原酶（MMP-8）ELISA 试剂盒（美国R&D systems公司），考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所），人骨膜蛋白ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）。

滤纸条（英国Whatman公司），P5多功能超声波牙科治疗仪（法国赛特力公司），Ga-Al-As半导体激光仪器（中国医学科学院生物医学工程研究所），全自动生化分析仪（日本希森美康公司），牙周检查探针、Gracey刮治器（上海豪孚迪医疗器械），Power wave XS2全波长酶标仪（美国Biotek公司）。

1.3 方法

1.3.1 牙周基础治疗和低能量激光照射

将18例入组患者依据随机数字表法分为对照组和实验组，对照组患者9例（共20颗患牙），实验组患者9例（共23颗患牙）。对照组和实验组均进行相同的牙周基础治疗，包括口腔卫生宣教、龈上洁治、龈下刮治和根面平整术。实验组在牙周基础治疗的基础上，于治疗后的第1、2、7天接受低能量激光照射治疗，波长为808 nm，输出功率为80 mW，能量密度为4 J/cm2，光斑面积为0.28 cm2。治疗中，将激光光纤探头缓缓插入患牙的牙周袋袋底，覆盖袋底及袋内壁，呈“之”字形进行上下提拉照射，每个牙周袋内照射时间为15 s，照射时用润湿的消毒棉卷进行局部阻隔，以防止对邻近口腔组织造成损伤[10]。

1.3.2 龈沟液中细胞因子水平检测

分别于治疗前、治疗后1、4周收集两组患者的龈沟液。收集前，用消毒棉卷对患牙进行局部隔湿；使用三用枪吹干牙面，选取患牙的牙周袋最深的位点，将Whatman滤纸条轻轻插入至袋底，有轻微阻力时停留30 s后取出；将滤纸条放入1.5 ml离心管后置于-80℃保存[10]。

进行细胞因子检测前，将冷冻的滤纸条在室温下复融；在4℃、3 000 r/min下，离心处理15 min；离心后吸取上清液 50 μl，置入灭菌 EP 管中（0.5 ml），置于-80℃低温冰箱冻存。细胞因子检测时，取出样品并在室温下解冻20 min，根据各试剂盒的说明书分别进行相关蛋白的检测，使用酶标仪检测各样品在405 nm处的吸光度值，计算细胞因子水平。整个检测过程均由一人独立完成。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量数据以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较

所有18例患者均完成了所有研究过程，期间未出现患牙脱落的现象。两组患者治疗前的一般临床资料比较见表1。结果表明，对照组与实验组患者的年龄、PD、CAL和龈沟出血指数（sulcus bleeding index，SBI）的差异均无统计学意义（均 P＞0.05）。

表1 两组重度牙周炎患者治疗前的一般资料（Mean±SD）

对照组（20颗患牙）与实验组（23颗患牙）龈沟液在治疗前的各细胞因子水平见表2。结果表明，两组龈沟液中 IL-1β、TNF-α、TGF-β、MMP-8、sICAM-1和骨膜蛋白水平的差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 LLLT对龈沟液中细胞因子的影响

结果表明，低能量激光治疗后1周，实验组龈沟液中IL-1β、TNF-α水平低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；但两组龈沟液中TGF-β、MMP-8、sICAM-1和骨膜蛋白水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。低能量激光治疗后4周，与对照组相比，实验组龈沟液中IL-1β、TNF-α水平的降低更为明显，差异具有统计学意义（均P＜0.01）；实验组龈沟液中MMP-8、sICAM-1水平明显降低，TGF-β和骨膜蛋白水平明显升高，差异均具有统计学意义（均 P＜0.05）。（表 3）

3 讨论

3.1 龈沟液中促炎因子水平变化

龈沟液是牙龈组织的渗出液，其量的多少与牙周炎症程度正相关，是反映牙周组织被破坏程度的重要指标。在牙周炎发生、发展过程中，致病菌可激活机体炎性细胞因子的释放，加重对牙周组织的破坏。龈沟液中炎症细胞因子的水平既可反映牙周炎对牙周组织的破坏程度，又可作为牙周炎治疗效果的评价指标。

IL-1β是破骨细胞激活因子的重要成分，可加重牙周组织破坏。IL-1β是具有多种生物学功能的细胞因子，不仅能够直接介导炎症反应的激活，还能促进多种黏附分子和趋化因子分泌，加重炎症反应，促进牙周组织的破坏[2]。本文结果表明，实验组和对照组分别在牙周基础治疗和牙周基础治疗联合LLLT治疗后，TNF-α、IL-1β的水平显著降低，且实验组在治疗后1周、4周，两种因子水平低于对照组。该结果说明，牙周基础治疗可清除牙菌斑，一定程度上减轻牙周炎症反应，但牙周基础治疗联合LLLT治疗可更有效地抑制炎症反应，减轻重度牙周炎牙槽骨的持续吸收，延缓牙齿脱落。此外，实验组和对照组TNF-α水平的降低，说明牙周基础治疗和LLLT治疗均能有效降低炎症因子水平，且基础治疗

表2 两组重度牙周炎患者治疗前龈沟液细胞因子水平（Mean±SD）

表3 治疗后不同时间重度牙周炎患者龈沟液中细胞因子水平（Mean±SD）

联合LLLT治疗对炎症的控制效果更佳，可有效减少牙周组织的继发性损伤，该结果与苏树霞等[13]和Ustun等[14]的研究结果一致。

MMP-8对牙周组织也有重要的破坏作用。Mancini等[15-16]在重度牙周炎患者的龈沟液中检测到MMP-8，且与稳定期牙周炎患者相比，其表现出更高的活性。本研究的结果表明，牙周基础治疗联合LLLT治疗可降低龈沟液中的MMP-8水平。

在正常及病变牙周组织龈沟液中均可检测到sICAM-1，但其在结合上皮表层中的表达最强[17]。本研究中发现，LLLT治疗后4周实验组的sICAM-1水平明显降低。其主要原因可能是在LLLT治疗中，激光通过细菌菌液气化、胞壁崩解、蛋白凝固、变性、坏死，起到杀菌作用，降低了细菌的sICAM-l表达。但在LLLT治疗后1周，这种差异还不明显。笔者前期的研究结果表明，LLLT治疗后，患者的PD及 SBI均有明显改善（P＜0.05）[10]，分析可能是 LLLT治疗降低了牙周袋内细菌数量，降低了龈沟液中sICAM-1水平，从而减轻了牙周局部过度的炎症和免疫反应。

3.2 龈沟液中生长因子水平变化

TGF-β在炎症性修复中发挥重要作用。本研究中发现，实验组和对照组的TGF-β水平在治疗后均有所升高，虽然在治疗后1周两组间的差异无统计学意义（P＞0.05），但在治疗后 4周，实验组 TGF-β 水平明显高于对照组（P＜0.05）。该结果说明，LLLT治疗有促进TGF-β分泌的作用，但短时间内效果不明显。因此，在今后的研究中需要进行更长时段的检测，以确定LLLT对TGF-β的促进作用。程群等[18]研究了Er∶YAG激光对人牙周膜细胞增殖的影响，也发现Er∶YAG激光可促进细胞分泌TGF-β。Lubart等[19]的体外实验研究结果表明，LLLT治疗后，TNF-α、IL-Iβ水平降低，TGF-β水平升高。该结果与本研究结果一致，说明LLLT可抑制炎性细胞向牙周组织的聚集和破骨细胞的形成，减轻对牙槽骨的破坏。

骨膜蛋白也参与牙周炎症的产生和进展。牙周炎患者龈沟液中骨膜蛋白的水平随牙周炎症程度加深而降低。在牙周术后愈合过程中，骨膜蛋白的表达会出现短暂的增强，提示骨膜蛋白可能在牙周组织愈合、维持组织的完整性方面发挥重要作用[20]。本研究中，在进行LLLT治疗后，龈沟液中的骨膜蛋白水平逐渐上升，4周后实验组与对照组的骨膜蛋白水平差异有统计学意义（P＜0．05）。说明与口腔基础治疗相比，LLLT治疗对重度牙周炎有更好的炎症控制作用。此外，重度牙周炎患者也会出现由创伤性咬合力导致的损伤，因此需要进行更合理、更严谨的实验设计，对炎症和咬合力因素与骨膜蛋白表达的关系进行进一步研究。

4 结论

LLLT治疗可在短期内有效降低重度牙周炎患者龈沟液中的 IL-1β、TNF-α、MMP-8 的水平，有利于控制牙周炎症，有效减少龈沟液中sICAM-1的表达，且对于牙龈出血症状效果明显。同时，LLLT治疗能有效促进TGF-β分泌，提升骨膜蛋白水平，减缓牙周组织破坏，对于牙周组织的恢复有一定作用。但由于本研究的病例数较少且观察期相对较短，对于LLLT治疗是否利于重度牙周炎患者拔牙后牙槽骨的保存和再生，有待进一步的研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突