QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜、蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留

倪杨 史玉琴 杨军军 石磊 张倩 熊融

（1 北京市林业果树科学研究院，北京 100093；2 北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093；3 北京市食用林产品质量安全监督管理事务中心，北京 100029）

我国是蜂产品出口大国，总出口额中90%以上销往美国、欧盟、日本等国。2002年以来，欧盟因为我国的抗生素残留超标，禁止我国蜂蜜进入欧盟市场，极大地影响了我国蜂产品的出口，蜂产品中主要抗生素包括氯霉素类、四环素类、磺胺类、硝基呋喃类及其他抗生素[1,2]。

硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（AHD）和呋喃妥因（SEM），是可以人工合成的广谱抗生素，由于其价格低廉、抗菌效果好，被广泛应用于畜禽、水产、蜂等动物传染病的预防和治疗，但由于硝基呋喃类药物很不稳定，在动物机体内很容易生成代谢物，由于代谢物稳定且有致癌致畸作用，欧盟将其列为A类禁用药物，并于1995年禁止在食用动物中使用[3]，我国也颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令[4]。目前，硝基呋喃类药物是国际动物源性食品贸易的必检项目。

近年来，硝基呋喃类代谢物的检测方法主要有ELISA[5]、免疫胶体金法[6]、酶联免疫技术[7]、同位素稀释质谱法[8]、液相色谱-串联质谱技术[9]、高效液相色谱-串联质谱法[10]、超高效液相色谱-串联质谱测定法[11]。酶联免疫法和胶体金免疫法具有快速、简便、灵敏、高特异性等优点，但无法进行定量检测，同时存在出现假阳性或假阴性风险。液相色谱-串联质谱法特异性更强，灵敏度和精确度更高，检测限更低，但样品前处理过程复杂，耗时长。QuEChERS方法步骤少，目标化合物损失少，试剂消耗少，经济环保快速高效，本研究目的是利用QuEChERS净化方法，结合UPLC-MS/MS，通过优化前处理以及色谱质谱条件，建立简便、高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂蜜、蜂王浆，市购。

4种硝基呋喃类代谢物标准品：3-氨基-2-噁唑酮（AOZ 80-65-9）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ 43056-63-9），德国Witega公司；1-氨基-2-内酰脲（AHD 2827-56-7）、氨基脲（SEM 563-41-7），德国Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；乙酸乙酯、甲酸、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾（均为分析纯），北京化工厂；2-硝基苯甲醛（优级纯），上海麦克林生化科技有限公司；Waters净化管，美国Waters公司；微孔过滤膜（13mm×0.22μm，尼龙），迪马科技有限公司；Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm），美国Waters公司；实验用水为Milli-Q制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

Waters Xevo TO-S超高效液相色谱-串联质谱仪，美国Waters公司；Milli-Q超纯水仪（电阻率＞18.2MΩ·cm），美国Millipore公司；GL-20G-II高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；FE20型实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZD-85气浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司；QL-8BB旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PL2002电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

称取2.00g蜂蜜样品、0.5g蜂王浆样品（精确至0.01g），分别置于50ml棕色旋盖离心管中，加入5ml 0.2mol/l盐酸和0.3ml 0.1mol/l 2-硝基苯甲醛，高速振荡30min，然后将离心管放入60℃水浴中反应30min，取出后冷却至室温。向离心管中加入10ml乙腈，涡旋1min，加入4g氯化钠，涡旋振荡1min后静置分层。吸取5.0ml上层乙腈加入到Waters净化管中，涡旋振荡1min后静置5min，过0.22μm有机滤膜，上机测定。

1.3.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制：准确称取4种硝基呋喃类代谢物标准品各10.0mg，用甲醇分别溶解并定容至10ml棕色容量瓶中，配制成1.0mg/ml的单标储备液。-18℃密封、避光保存，保质期6个月。

混合标准储备液的配制：准确吸取单标储备液各1.0ml混合于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成10.0μg/ml的混合标准储备液。4℃避光保存，保质期1个月。

基质标准溶液的配制：对蜂蜜和蜂王浆样品按照1.3.1预处理后进行仪器分析，当4种硝基呋喃类代谢物的定性与定量离子信噪比＜3时，该样品确定为空白基质。称取6份蜂蜜、蜂王浆空白基质于50ml棕色离心管中，分别加入适量混标储备液，按照1.3.1操作步骤进行样品预处理，配制成浓度分别为1.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的基质标准溶液，现配现用。

1.3.3 超高效液相色谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）；柱温：40℃；流速：0.2ml/min；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸-水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5min、90% B、Curve 5，0.5～1.0min、90%～40%B、Curve 5，1.0～3.0min、40%～10% B、Curve 6，3.0～4.0min、10% B、Curve 6，4.0～4.5min、90% B、Curve 3；进样量：2μl。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI+）；毛细管电压：2.5kV；离子源温度：150℃；锥孔电压：40V；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650l/h；碰撞气：氩气（纯度大于99.9%）；采集模式：多反应监测（MRM）。目标物的定性定量离子对、裂解电压、碰撞能量的优化参数详见表1。

表1 4种硝基呋喃类代谢物质谱参数

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 衍生时间与温度的选择

如图1所示，随着衍生温度的增加，衍生化反应迅速，衍生效率提高。随着时间的延长，衍生物呈下降趋势。衍生时间1h后，响应值逐渐降低，当温度达到70℃时，AMOZ响应值略增高，而其他3种物质与60℃衍生无差异，综合考虑确定衍生温度为60℃，时间为30min，衍生产物生成相对稳定，衍生效果最好。

图1 不同衍生时间、衍生温度下4种硝基呋喃类代谢物含量变化

2.1.2 提取及净化过程的优化

本方法采用的是乙腈作为萃取溶剂，乙腈极性较大，提取能力较强，经过盐析后使得乙腈相与水相分层。实验中发现，采用乙腈作为萃取剂时，当调节pH值7.5时，乙腈层产生增稠现象。采用不调节pH，结合QuEChERS法净化直接进样，以添加10.0μg/kg标准溶液为例，本方法与国标方法进行对比，结果见表2。

表2 方法对比

2.2 质谱测定条件的优化

采用ESI离子源直接进样方式，配制浓度为100ng/ml的4种硝基呋喃类代谢物衍生后的标准溶液注入到离子源中，对母离子[M+H]+质量数5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（m/z 335.1）、1-氨基-1-乙酰脲（m/z 249.1）、3-氨基-2-噁唑酮（m/z 236.1）、氨基脲（m/z 209.1），进行二级碎片扫描。选择稳定性、丰度高的两个碎片离子作为子离子，然后分别优化锥孔电压和碰撞能量，选择最佳质谱条件。

2.3 色谱测定条件的优化

色谱条件直接影响目标组分的离子化效率和峰形，流动相多以乙腈、甲醇、水为流动相，针对化合物结构特性可加入适当浓度的甲酸和乙酸铵。由于甲醇增强了泵的压力，故本法忽略甲醇。采用乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含5mmol/l乙酸铵）和乙腈-水（含5mmol/l乙酸铵、0.1%甲酸）流动相体系优化。一般为了提高离子化效率，改善峰形，正离子选用甲酸，负离子选择乙酸铵作为调节流动相pH试剂。在梯度洗脱条件下，采集时间6min，流速0.2ml/min，柱温40℃条件下，发现乙腈-水（含0.1%甲酸）作为流动相使目标物离子化提高，峰形尖锐。在MRM模式下测定，蜂蜜、蜂王浆基质中添加100ng/ml的4种硝基呋喃类代谢物混合表样的色谱图，见图2。

图2 蜂蜜、蜂王浆空白基质添加4种硝基呋喃类代谢物多反应监测色谱图

2.4 色谱柱的选择

寻找一根高分离度且耐受性好的色谱柱，是开发方法的首要条件之一。本文选用BEH C18、HILIC和HSS T33种不同型号的柱子。BEH C18色谱柱采用第二代杂化颗粒技术，具有良好的保留能力和分离效率以及宽带pH（1～12）使用范围，并且具有极好的稳定性和超长的使用寿命。

由于HILIC色谱柱为亲水色谱柱，分离基于多模式混合保留机制，分析物的带电状态、色谱填料以及缓冲液浓度和流动相pH值，都对HILIC保留效果发挥作用，高比例的有机相易挥发，从而提高离子化效应和质谱响应。HSS T3色谱柱其实是100%水性兼容的C18色谱柱，用来保留和分离极性水溶性的有机小分子，特别适用于反相色谱分离中增强对极性化合物和代谢物的保留。这3种色谱柱的性能和分离都可很好的分离硝基呋喃类代谢物质，从使用的耐用性和价格方面考虑，故选用BEH C18色谱柱。

2.5 线性范围和检出限

按照样品操作步骤同步操作浓度为1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml的阴性样品基质标准溶液，具有良好的响应和线性关系（R＞0.999）。

2.6 回收率和精密度

本方法采用外标法定量，选用阴性蜂蜜及蜂王浆样品进行添加回收和精密度实验。在两个样品中分别进行添加，添加浓度均为1.0、10.0和100.0μg/kg，混匀后静置，使标准溶液被样品充分吸收，然后测定，每个添加水平平行测定6次，计算加标回收率范围和相对标准偏差（RSD），结果详见表4。

表3 标准曲线方程及检出限

表4 硝基呋喃类代谢物回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

本研究利用QuEChERS净化方法结合超高效液相-串联质谱技术建立了蜂蜜、蜂王浆中硝基呋喃类代谢物的检测方法，优化了前处理方法及色谱质谱条件，获得了满意的分离效果和检测灵敏度，其回收率、精密度和检出限均满足残留分析的要求。用最终建立的分析方法进行添加回收实验，并与国标进行比对，结果表明本方法有效提高了回收率，可以作为蜂蜜、蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留的分析方法，能够满足日常检测的需要。

本方法重复性好，准确度高，且操作简单，大大简化了前处理过程，对于批量化检测具有明显优势。