肥胖和肥胖抵抗大鼠的正畸牙移动速率及压力侧骨改建差异研究

罗 虹 ，武红彦 ，谭 玺 ，戴红卫 , ，黄 兰 ,

1. 重庆医科大学附属口腔医院正畸科，重庆401147；2. 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆401147；3. 重庆市高校市级口腔生物 医学工程重点实验室，重庆401147

世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据显示，2016 年有超过19 亿的成年人超重，超过6.5 亿的人患有肥胖[1]。个体对致肥胖环境的敏感性是由复杂因素决定的[2]。研究[3-4]发现，排除遗传因素后，饮食在致肥胖过程中可能起了关键作用，尤其是高脂饮食（high-fat diet，HFD）。但是，有人生活在致肥胖环境中，却仍可保持苗条的身材。动物实验也有类似现象。Levin 等[5]首先报道了在给SD 大鼠喂食HFD 后，一些大鼠发展成为HFD 诱导的肥胖（diet-induced obese，DIO）大鼠，而另一些则能在易致胖环境中保持体质量并发展成为HFD 诱导的肥胖抵抗（diet-resistant，DR）大鼠。这些现象在其他研究中也被证实[6-7]。

肥胖与骨代谢之间的相互作用十分复杂，机制至今仍不清晰。越来越多的证据表明，HFD 诱导的肥胖会对骨骼质量和骨骼健康产生不利影响[8-9]。研究[10]发现HFD 可以通过增加破骨细胞和减少成骨细胞来破坏颌骨骨量和骨小梁结构，并造成牙槽骨水平性骨吸收，但尚未有关于HFD 诱导的DR 大鼠牙槽骨研究的报道。在正畸牙移动过程中，机械应力触发牙周膜中的应力/应变分布改变，启动信号级联，实现了牙槽骨张压力侧或增殖或吸收的骨改建，从而使牙齿发生移动。而破骨细胞的数量和活性以及压力侧骨改建的快慢决定了牙齿牙移动的速率[11]。已有临床报道[12-13]肥胖会影响正畸牙移动的速率。但是，目前关于肥胖与正畸牙移动的基础研究很少，尤其关于在机械压应力环境下DR 大鼠牙槽骨发生的变化及可能的机制研究 更少。

本研究通过建立DIO 和DR 大鼠正畸牙移动模型，观察DIO 和DR 大鼠正畸牙移动速率和压力侧骨改建中的变化，探索肥胖和肥胖抵抗状态对牙齿加力过程中的影响，进而探索其可能存在的机制，以期为肥胖和肥胖抵抗患者的临床正畸治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40 只3 周龄SD 雄性大鼠，平均体质量为（50±10） g，由重庆医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号为SYXK（渝）2013-0002。实验方案和操作均获得重庆医科大学附属口腔医院伦理委员会批准（2019 年伦审46 号）。

1.2 材料、试剂和设备

普通饲料（江苏省协同医药生物工程公司），高脂饲料（美国Research Diets 公司），Micro-CT（瑞士SCANCO 公司），正畸镍钛螺旋拉簧（北京有研医疗器械有限公司），光固化树脂（美国3M Unitek 公司），抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（No.387，美国Sigma 公司），免疫组化检测试剂盒（SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司），骨钙蛋白一抗（武汉塞维尔生物科技有限公司），显微病理图文分析系统（OLYMPUS BX41，日本Olympus 公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS，重庆蒙博生物科技有限公司），石蜡切片机（德国Leica 公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立肥胖和肥胖抵抗大鼠模型 选取40 只SD 大鼠，在第1 周给全部大鼠喂食普通饲料（normal diet，ND）以适应新环境。1 周后，将40 只SD 大鼠随机分为2 组：ND 组（n=10），给予普通饲料喂养；HFD 组（n=30），给予高脂饲料喂养。每周称量1 次体质量，测量1 次体长。经过肥胖诱导期（8 周）后，将HFD 组大鼠按照体质量增加量排序，体质量增加量位于前1/3 的大鼠为DIO 组（n=10），体质量增加量位于后1/3 的大鼠为DR组（n=10），体质量增加量位于中1/3 的大鼠排除[14]。

1.3.2 建立正畸牙移动模型 将ND 组、DIO 组和DR 组分别建立正畸牙移动模型。将大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，用0.2 mm 结扎丝将正畸镍钛螺旋拉簧固定在大鼠上中切牙和左侧上颌第一磨牙之间，以提供0.49 N 的持续牵引力，使左侧上颌第一磨牙发生近中移动。为了加强固位，在上中切牙和左侧上颌第一磨牙的牙颈部制备了约0.5 mm 的固位沟，并用光固化树脂固定。未放置加力装置的右上颌第一磨牙作为对照侧。每天检查1 次加力装置是否有脱落，如发现有脱落或损坏，则立即重新结扎。

1.3.3 制备标本 3 组大鼠放置加力装置加力14 d，空腹过夜后处死。收集大鼠的上颌磨牙及其周围牙槽骨、附睾脂肪和肾周脂肪。对附睾脂肪和肾周脂肪进行称重，计算脂体比，脂体比=（附睾脂肪质量+肾周脂肪质量） /体质量×100%。标本在4%多聚甲醛溶液中固定。计算Lee's 指数，Lee's 指数=（体质量×103/体长）1/3。

1.3.4 Micro-CT 扫描与分析 使用Micro-CT 对3 组大鼠上颌磨牙及其周围牙槽骨标本进行扫描，扫描条件设置为：①图像分辨率为15 μm。②电压为70 kV。③114 µA的电流。每个标本的平均扫描时间约20min。扫描结束后，使用Micro-CT 自带的程序对标本进行分析。通过测量CT 图像上第一磨牙远中最凸点与第二磨牙近中最凸点之间的距离来计算牙齿的移动距离。在上颌第一磨牙近中根近中侧的根中1/3 处，距离牙根表面300 μm 处选取一个300 μm×300 μm×300 μm 的立方体，分析该处骨小梁的骨微结构。主要测量参数为：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积分数（percentage trabecular bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁数（trabecular number，Tb. N）、骨小梁宽度（trabecular thickness，Tb. Th）和骨小梁间隙（trabecular separation，Tb. Sp）。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 3 组大鼠上颌骨标本固定24 h 后，置于10% 的中性乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脱钙6周。标本依次进行脱水、透明和包埋，按平行于上颌第一磨牙近远中的方向用石蜡切片机连续切片，切片厚度为7 μm。选取第一磨牙牙根及牙周组织完整的切片，经过脱蜡透明后，按照抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒说明书中的步骤进行染色。

1.3.6 免疫组织化学染色 将“1.3.5”制备的组织切片先进行脱蜡和水化。然后行抗原修复，再用免疫组化检测试剂盒中的10%山羊血清封闭，以减少背景染色。甩去封闭液，将OCN 一抗按1:100 的比例稀释，放入湿盒，4 ℃过夜孵育。然后用PBS 缓冲液冲洗，再滴加3%过氧化氢阻断剂，PBS 冲洗，加入二抗孵育20 min。最后进行二氨基联苯胺（3-3'-diaminobenzidine，DAB）显色、复染胞核和脱水封片。

图1 3 组大鼠体质量、脂体比和Lee's 指数比较Fig 1 Comparison of body weight，adiposity index and Lee's index of rats in 3groups

1.3.7 图像分析 采用OLYMPUS BX41 显微病理图文分析系统观察计算图像的平均光密度和压力侧牙槽骨表面的破骨细胞数。破骨细胞计数在上颌第一磨牙远中颊根的近中即压力侧随机选取3 个不重叠视野（400×）进行图像采集；平均光密度选取压力侧牙周膜区域的视野（400×）进行测量。由同一实验者在不同的时间点对每个样本进行3 次测量后取平均值。

1.4 统计方法

采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行分析。定量数据用x—±s 表示。用单因素方差分析和Tukey 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠体质量、脂体比和Lee's 指数比较

8 周的饮食干预后，3 组大鼠的比较结果见图1。结果显示：DIO 组的体质量（521.70±6.27） g 明显高于ND组（424.80±6.08）g 和DR 组大鼠（444.00±4.54）g，且差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000）；DIO 组的脂体比明显高于ND 组和DR 组（P=0.001，P=0.008）；DIO 组的Lee's 指数明显高于ND 组和DR 组（P=0.000，P=0.007）。

2.2 3 组大鼠牙移动距离比较

放置加力装置14d 后，ND、DIO 和DR 组大鼠的牙移动距离比较见图 2。结果显示：DR 组的牙移动距离（0.09±0.01）mm 与DIO 组（0.22±0.02）mm 和ND 组（0.17±0.02）mm 比较，差异有统计学意义（P=0.000，P=0.005）。

2.3 未加力时3 组大鼠牙槽骨近中侧骨质参数的比较

使用Micro-CT 观察加力前3 组大鼠近中侧牙槽骨骨小梁微结构的变化，结果见图 3。结果显示： ND 组的BMD 高于DR 和DIO 组（P=0.029，P=0.001），BV/TV高于DR 和DIO 组（P=0.025，P=0.016）；Tb.Sp 均低于DR 和DIO 组（P=0.014，P=0.000）；DR 组的Tb.Sp 低于DIO 组（P=0.000）。

图2 3 组大鼠牙移动距离的比较Fig 2 Comparison of the teeth movement distance of rats in3 groups

图3 未加力时3 组大鼠骨质参数的比较Fig 3 Comparison of bone parameters of rats in 3 groups without force application

2.4 3 组大鼠牙槽骨近中（压力）侧骨质参数的变化

加力14d 后，3 组大鼠近中根压力侧骨小梁微结构的变化如图 4 所示。Micro-CT 分析显示：DR 组与ND 组的BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th，均高于DIO 组，且差异有统计学意义（P=0.001，P=0.007；P=0.000，P=0.000；P=0.005，P=0.014；P=0.000，P=0.001）；ND 组与DR 组的Tb.Sp 低于DIO 组，且差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000）。加力14 d 后，DR 组的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 为3 组中最高，而DIO 组的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 为3 组中最低。

图4 加力14 d 后3 组大鼠骨质参数的比较Fig 4 Comparison of bone parameters of rats in 3 groups after 14 days of orthodontic tooth movemen

2.5 TRAP 染色结果

沿骨表面的多核TRAP 阳性细胞被认为是活性破骨细胞。加力前，ND 组、DIO 组和DR 组的压力侧少见或未见破骨细胞（图5）。放置加力装置14 d 后，DR 组的破骨细胞数量缓慢增加并低于DIO 组和ND 组（P=0.001，P=0.005）。而DIO 组的破骨细胞数量迅速增多，明显高于ND 组和DR 组的破骨细胞数量（P=0.002，P=0.001）。

2.6 免疫组织化学染色结果

骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）是钙化相关蛋白中的一种，是成骨细胞的特异性标志物，在成骨细胞分化末期表达。3 组OCN 比较结果见图6。结果显示：加力前，DR 组OCN 的阳性表达多于DIO 组（P=0.004）。加力14 d 后，DIO 组OCN 的表达较ND 组增多（P=0.047）。

图 5 TRAP 染色和破骨细胞数的变化（×400）Fig 5 TRAP staining and changes of the number of osteoclasts in each group (×400)

图6 3 组大鼠OCN 免疫组织化学染色（×400）Fig 6 Immunohistochemistry staining of OCN in periodontal ligament in 3 groups of rats (×400)

3 讨论

肥胖是骨质疏松症和骨稳态失衡的一个独立危险因素[15]。本研究中，在未加力时，Micro-CT 分析显示HFD诱导的肥胖降低了颌骨骨密度和骨量，从而对骨质量和骨骼健康产生有害影响，这与既往研究[16]的结果是一致的。本研究还发现同样进食HFD 的DR 大鼠的骨密度和骨量也受到了损害，但是其受损程度较DIO 大鼠要轻一些。结果提示，HFD 会在一定程度上损害DR 大鼠颌骨的骨微结构。研究[17]发现，长期喂养高脂饲料会显著降低DR 小鼠的股骨性能参数如骨强度、直径和股骨钙质量，本实验结果与其一致。

本研究发现，DR 大鼠压力侧骨改建的速度慢于DIO大鼠。Micro-CT 数据显示，在加力14 d 后，DIO 组的Tb.N 和Tb.Th 显著下降，导致Tb.Sp 迅速增大，从而引起BMD 和BV/TV 迅速降低，这表明在压力侧有大量的骨吸收发生。研究[11,18]表明破骨细胞在压力侧骨改建过程中起着至关重要的作用。在加力14 d 后，本实验中DIO 组大鼠压力侧牙槽骨表面的破骨细胞数是最多的，并且显著高于ND 和DR 组大鼠。既往研究[19]证实，HFD 可通过改变骨髓环境促进破骨细胞生成导致年幼小鼠骨质流失。然而，DR 组大鼠压力侧破骨细胞数却显著低于ND 和DIO组，并且是3 组大鼠中破骨细胞数最少的。DR 组大鼠在加力14d 后的骨微结构参数如BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 为3 组中最高，同时显著高于DIO 组。因此，HFD可能是通过促进破骨细胞生成而引起DIO 大鼠压力侧发生明显的骨吸收，从而导致了活跃的骨改建。DR 大鼠骨改建变得缓慢的原因可能是其抑制了破骨细胞的 生成。

破骨细胞是影响牙齿移动速率的关键因素[18]。本研究发现HFD 引起的肥胖或者肥胖抵抗可能通过促进或抑制破骨细胞生成影响骨骼重塑过程来增快或减慢牙移动速率。既往研究发现，在牙齿排齐阶段的第1 周内，肥胖患者的牙移动速率要明显快于正常体质量患者；但是在1 周后，各组之间的牙齿排齐速率却没有差异[12]。我们发现ND 组和DIO 组在第14 天的牙移动速率没有统计学差异，原因可能是DIO 组成骨细胞分化和活性较ND 组增强。同时，DR 组在第14 天的牙移动速率显著慢于DIO 组和ND组，并且其牙移动速率在3 组中是最慢的。

本研究中，DIO 大鼠表现出明显的肥胖倾向，相较于ND 组大鼠，其体质量、脂体比和Lee's 指数显著增加。同样是进食HFD 8 周，DR 大鼠的相关指标却显著低于DIO 大鼠。这与既往研究[20]结果一致。脂肪组织分泌的脂肪因子如瘦素、脂联素、抵抗素等能影响破骨细胞的活性和数量以及成骨细胞和脂肪细胞的分化[21-22]。瘦素对骨代谢的影响是复杂多样的，可以通过中枢和外周神经途径直接或间接地调控骨的形成[23]。脂联素可以抑制破骨细胞的活性，还可通过诱导成骨细胞的分化和增殖来减少骨吸收[24-25]。抵抗素可通过促进成骨细胞增殖和破骨细胞分化来刺激骨骼重塑[26]。DIO 大鼠和DR 大鼠之间体脂质量的差异，可能影响了相关脂肪因子的分泌，从而影响了破骨细胞的数量和活性，最终影响了2 组的牙移动 速率。

综上所述，HFD 引起的肥胖或者肥胖抵抗可能通过促进或抑制破骨细胞生成，从而影响骨改建过程来增快或减慢牙移动速率。

参·考·文·献

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