具核梭杆菌相关细菌生物膜促进巨噬细胞M2 型极化和结肠癌化疗耐药的研究

陆诗媛，洪 洁，陈萦晅，陈锦先，钟 鸣，房静远

1.上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001；2.上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科，上海 200127

肠道菌群是影响结肠癌进展和预后的重要因素之一，产肠毒素脆弱拟杆菌（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF）、 具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.n）、pks 岛阳性大肠杆菌（pks+Escherichia coli，pks+E.coli）等肠道细菌被认为与结肠癌的发生发展和预后相关[1-3]。细菌生物膜是一种在生物或非生物性表面形成的细菌集合体，包含菌体、胞外聚合物等组分，与细菌耐药以及牙周炎、伤口感染、肠炎、肺炎等疾病相关[4]；近期有研究提示细菌生物膜在部分结肠癌组织中存在，可能通过影响细胞代谢和肠道免疫参与肠癌的进程[5-11]。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是一种骨髓来源的免疫细胞，参与肿瘤微环境调节和肿瘤的发生发展[12]。其中，M2 型巨噬细胞介导结肠癌的发生发展和化疗耐药，与结肠癌患者的预后不良 相关[13-14]。

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其患病率和病死率在全球位居前五[15-16]。几十年来，结肠癌的5 年生存率有所提高，但进展期和晚期结肠癌的预后仍然不佳[17]。目前结肠癌的术后化疗辅助治疗仍以FOLFOX 化疗方案[亚叶酸钙、5- 氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）、奥沙利铂（oxaplatin，LOHP） ]、XELOX 化疗方案（卡培他滨、LOHP）和FOLFIRI 化疗方案（亚叶酸钙、5-FU、伊立替康）等为主，而化疗耐药是术后患者复发的主要原因之一[18-19]。有研究[6,20]提示F.n 在结肠癌相关的生物膜中普遍存在；也有文献[21-22]报道F.n 可以调节肿瘤免疫微环境，影响TAMs 的极化；本课题组前期研究[23]提示F.n 可促进结肠癌的化疗耐药。这些研究提示F.n 细菌生物膜可能与肿瘤免疫微环境和结肠癌患者的化疗耐药相关。

本研究从临床结肠癌组织检测和细胞体外实验等方面，阐述细菌生物膜与肿瘤相关巨噬细胞极化分型、结肠癌化疗耐药的关系，旨在探究细菌生物膜与结肠癌耐药复发的关系，探究清除细菌生物膜对改善结肠癌预后的 意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

1.1.1 实验材料 本研究使用的肠癌组织来源于上海交通大学医学院附属仁济医院收治的结肠癌患者。组织样本收集和临床信息采集均符合医院伦理委员会要求。人肠癌细胞系HCT116（ATCC CCL-247）、DLD1 （ATCC CCL-221）、Caco2 （ATCC HTB-37），人单核细胞THP-1 （ATCC TIB-202），小鼠巨噬细胞RAW264.7 （ATCC SC-6003）和具核梭杆菌标准菌株（ATCC 25586）均购自美国模式培养物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）；小鼠肠癌细胞系MC38 由许杰研究组惠赠。

1.1.2 试剂 McCoy's 5A、RPMI-1640、DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培养基，磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），胎牛血清均购自美国Gibco Life Technologies 公司。LOHP 和5-FU 均购自美国Selleck Chemicals 公司。抗CD68 抗体（#76437）购自美国Cell Signaling Technology 公司， 抗CD206 抗体（#ab64693）购自英国Abcam 公司，抗CD11c 抗体（#TA323539）购自美国Origene 公司。Cell Counting Kit-8（CCK8） 试剂盒购自日本同仁公司。免疫荧光原位杂交全细菌探针（EUB338-CY3）和具核梭杆菌探针（F.n-FITC）均购自广州外显子公司。阿斯利新蓝、过碘酸、苏木精、雪夫 （Shiff's）液等化学试剂均购自上海虹桥乐翔医用试剂有限公司。内源性过氧化物酶阻断剂SP KIT-A3 和酶底物显色剂（#DAB-0031）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。组化通用二抗（#D-3304）购自上海长岛生物技术有限公司。FITC 染料（#F5027）购自苏州宇恒生物科技有限公司。脑心浸出液肉汤粉末（CM1135B）购自美国OXOID 公司。

1.1.3 实验仪器 普通光学显微镜及倒置荧光显微镜均购自日本Olympus 公司。冷冻切片机购自德国徕卡病理系统。厌氧操作台（DG250，Don Whitley Scientific，UK）。实时荧光定量PCR 仪（One-Step Plus，Thermo Fisher Scientific，美国）

1.2 方法

1.2.1 组织学检测 组织学检测均使用冷冻新鲜组织标本，制作冰冻切片（9 μm，厚度），以Carnoy's 固定液（乙醇:乙酸=3:1）固定1h，灭菌去离子水洗涤6 次（5 min/次）后，分别进行PAS-AB（periodic acid Schiff and Alcian blue stain）染色、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 检测和免疫化学染色（immunohistochemistry，IHC）检测。PAS-AB 染色步骤为：阿斯利新蓝滴染20 min，流水冲洗5 min；过碘酸滴染20 min，流水冲洗5 min；Shiff's 液滴染15 min，流水冲洗10 min；最后以苏木精复染细胞核，封片后以光学显微镜观察。FISH 按照探针说明书操作，封片后以荧光显微镜观察，并以文献报道[10,24]的标准评估细菌生物膜存在状态。IHC 按照标准流程操作，步骤为：过氧化物酶阻断剂处理15 min，PBS 洗涤，10%羊血清封闭30 min，一抗孵育4 ℃过夜（CD68 以1:800 配置，CD11c 以1:100 配置，CD206 以1:4 000 配置），PBS 洗涤后以酶底物显色剂显色，并以苏木精复染细胞核，封片后以光学显微镜观察。

1..2.2 细胞培养 HCT116 细胞系以McCoy's 5A，DLD1、THP-1 细胞系以RPMI-1640，Caco2、MC38、RAW264.7 细胞系以DMEM 配置完全培养基培养（含1%双抗、10%胎牛血清），并置细胞培养箱（37 ℃，5%CO2）标准环境培养。其中THP-1 和RAW264.7 细胞系使用热灭活（56 ℃，30 min）的血清。THP-1 细胞提前24 h 以佛波醇-12-豆蔻-13-醋酸（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA，100 μg/mL）诱导分化为贴壁的巨噬细胞。

1.2.3 生物膜培养 F.n 在厌氧操作台以BHC 培养基（心脑浸出液肉汤、氯化血红素、结晶紫等配置）37 ℃恒温培养24 h 备用[23]。F.n 标记：生长中期的菌液以2 000×g离心10 min，弃上清，以PBS 洗涤2 次后，加入FITC 染料（0.1 mg/mL）孵育2 h，以PBS 洗涤5 次去除多余的FITC 染料，PBS 重选备用。

非生物体表面的生物膜培养：以中期菌液调整至 D （600）=0.5，以每孔200 μL 加入96 孔板培养24 ～48 h即生成生物膜。生物体表面的生物膜培养：Caco2 结肠癌细胞在12 孔板内生长10 d 形成单细胞层，以FITC 染料标记的F.n 按感染复数（multiple of infection，MOI）为50 的浓度与细胞共孵育，8 ～24 h 后观测生物膜形成情况[25]。F.n 培养上清收取：培养好的菌液以2 000×g 离心15 min 后，以0.22 μm 滤器滤除菌体，留取培养上清（代谢物）备用。

1.2.4 药物毒性实验 MC38、 HCT116、 DLD1 细胞在不同浓度的F.n 培养上清处理2 ～3 h 后，PBS 洗涤，胰酶消化、计数，以8 000 个细胞/孔铺到96 孔板过夜贴壁，换入含有加入对应半数抑制浓度 （ half inhibit concentration，IC50）的LOHP/5-FU 化疗药物的完全培养基200 μL/孔，48h 后以CCK8（1 μL/100 μL 配置）孵育2 h 后读取D （450）值，并以各组不含化疗药物的对照组为标准，计算相对生长抑制率。

1.2.5 细胞共培养 本研究采用细胞上清共培养体系。将处理/未处理的肠癌细胞提前24 h 换为单纯培养基，收取24 h 的培养上清，10 000×g 离心15 min 后收取上清；或以液氮冻融后离心收取细胞裂解液，以合适浓度加入巨噬细胞培养基做共培养。将处理/未处理的巨噬细胞提前24 h 换为单纯培养基，收取24 h 的培养上清，10 000×g离心15 min 后收取上清，以合适浓度加入肠癌细胞培养基做共培养。

1.2.6 RNA 提取和实时荧光定量PCR 处理后的细胞以Trizol 法提取总RNA（F.n 菌体在加入Trizol 后100 ℃加热10 min 促进菌体裂解），根据反转录试剂（Takara）说明书取1 μg RNA 反转录为cDNA，并以SYBR Green染料（Takara）和实时荧光定量PCR 仪检测，细胞选取β-actin 为内参、菌体选取Fuso-16s 为内参，以2-ΔΔCt定量分析。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.7 巨噬细胞极化检测 RAW264.7 以不同条件（肠菌培养上清、细胞培养上清或细胞裂解液，制备方法见“1.2.3”和“1.2.5”）共培养6 h 后，分别检测细胞极化情况：① 以光学显微镜观测细胞形态，以长梭形为M2 型。②收取RNA，以实时荧光定量PCR 检测Il10、Il12b 基因的表达水平。③制作细胞爬片后，以CD206 为M2 型巨噬细胞指标，做免疫化学染色评估细胞极化情况。

1.2.8 具核梭杆菌最小抑菌浓度检测 液基或生物膜培养的F.n，分别以含有0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL 甲硝唑的培养基稀释至106CFU/mL（clone formation unit）的浓度，加入96 孔板（每组设置6个重复），培养24h 后测量D （600）值；并以上述各组培养后的菌液做涂板培养，48h 后观测菌落形成情况。以吸光度最先降低（菌落最先消失）的药物浓度为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件做数据分析。定量资料以x—±s 表示。符合正态分布的2 组间定量资料分析采用student's t检验（所有检验均为双尾检验），P<0.05 表示差异有统计学意义。符合正态分布的各组间定量资料的分析使用oneway ANOVA 检验；当P ≥0.05 时，认为方差齐，用LSD 法进一步作多重比较；方差不齐性时，用Dunnett's t 检验进一步作多重比较，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 具核梭杆菌相关生物膜促进结肠癌细胞耐药

研究[1,26]提示肠菌代谢物在免疫调节和癌症进程中发挥作用，但机制不明。因此，我们关注F.n 代谢产物在生物膜与非生物膜不同状态下作用的差异。在96 孔板中培养F.n 生物膜，并收集培养上清（代谢产物）分别与结肠癌细胞系HCT116、DLD1、MC38 共培养，给予LOHP、5-FU 处理48h 后，通过CCK8 细胞活性检测评估化疗药物的细胞毒性，并以实时荧光定量PCR 检测耐药基因表达变化。结果显示，经生物膜培养来源的F.n 代谢产物（biofilm-based F.n-culture medium，BF-CM）处理的肠癌细胞，与液基培养状态代谢产物（planktonic F.n-culture medium，P-CM）处理的相比，LOHP/5-FU 作用下生长抑制率更低[D（450）值更大]，而耐药相关基因（MDR1/Abcb1a/Abcb1b）表达水平更高（图1）。结果提示生物膜状态的F.n 有更强的促进细胞耐药的作用。

2.2 细菌生物膜与结肠癌患者的化疗耐药和TAMs 浸润相关

为探究细菌生物膜与化疗耐药的临床相关性，研究选取8 个耐药复发和8 个未复发的术后化疗结肠癌患者的组织标本（表2），以FISH（EUB338 探针、F.n-FITC 探针）技术检测组织样本生物膜和F.n 的存在情况，2 组间F.n阳性率差异无统计学意义。结果提示7/8 个复发患者的组织生物膜阳性，而未复发组中仅2/8 个（图2A，表2）。进一步以IHC 检测肿瘤组织TAMs 的浸润和极化情况，研究发现复发组中M2 型TAMs 比例为59.81%±5.54%（其中BF 阳性组织为63.60%±4.66%），相比未复发组的43.94%±4.51% 有明显提高 （其中BF 阴性组织为41.97%±5.57%），见图2B。以上结果说明，细菌生物膜阳性与肠癌术后耐药复发率正相关，且与TAMs（M2 型）的浸润度相关。

表2 结肠癌患者的临床信息Tab 2 Clinical information of patients with colon cancer

图1 F.n 代谢产物对肠癌细胞化疗药物作用和耐药基因表达的影响Fig 1 Changes of growth inhibition under chemicals and mRNA expression in CRC cell lines

图2 结肠癌组织生物膜检测和肿瘤相关巨噬细胞浸润分析Fig 2 Biofilm existence and TAMs infiltration in tumor tissues of colon cancer patients

2.3 具核梭杆菌相关生物膜促进巨噬细胞M2 型极化

研究[21]报道F.n 可以诱导TAMs 的M2 型（促癌性）极化。为探究生物膜状态的F.n 是否作用更强，研究以BF-CM 和P-CM（同时以空白细菌培养基BHC 作阴性对照）分别作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7 和THP-1 来源的巨噬细胞，通过观测细胞形态学特征（图3A）、qRT-PCR检测标记基因，分析巨噬细胞的极化分型。实时荧光定量PCR 显示，BF-CM 比P-CM 刺激的巨噬细胞IL10/Il10 表达量更高（而BHC 作用后表达变化不大，图3B ～C）。

图3 具核梭杆菌相关生物膜促进巨噬细胞M2 型极化Fig 3 F.n-related bacterial biofilm promotes macrophage M2-type polarization

2.4 肿瘤相关巨噬细胞与结肠癌细胞的相互作用

将BF-CM、P-CM 和BHC 处理后的肠癌细胞与巨噬细胞共培养，检测巨噬细胞极化情况，结果提示BF-CM 作用后的肠癌细胞诱导M2 型极化作用更强（图4A ～B）。同样，将BF-CM、P-CM 和BHC 共刺激后的巨噬细胞与肠癌细胞共培养，检测其对LOHP/5-FU 的药物反应和耐药基因表达水平。结果显示，相比P-CM，LOHP/5-FU 对BF-CM 刺激后的巨噬细胞共培养下的肠癌细胞的细胞生长抑制率更低，且耐药相关基因表达水平更高（图4C ～K）。

图4 肿瘤相关巨噬细胞与结肠癌细胞的相互作用Fig 4 Crosstalk between CRC cells and macrophages

2.5 具核梭杆菌相关生物膜促进菌体本身耐药

图5 具核梭杆菌相关生物膜促进菌体本身耐药Fig 5 Reduced sensitivity to Metronidazole of F.n. under biofilm-based status.

结晶紫染色验证，96 孔板培养24 h 后F.n 生物膜形成（图5A）。活细胞表面生物膜形成结果提示，生物膜来源的F.n 有更强的生物膜形成能力（图5B）。将不同浓度的甲硝唑分别加入生物膜和液基悬浮状态的F.n 培养体系中，24 h 后酶标法[D（600）]检测F.n 细胞活力，并将对应菌液涂板培养。吸光度显示：液基悬浮状态F.n 的MIC 为0.01 μg/mL，而生物膜状态F.n 的MIC 为0.1 μg/mL，平板培养结果与之一致（图5C ～D）。进一步检测F.n 在KEGG-QS（quorum-sensing）通路富集基因的表达变化，实时荧光定量PCR 结果提示群体效应/耐药相关基因FN1431 和FN1506 表达在生物膜状态下增高（图5E），说明细菌生物膜可以提高F.n 的耐药和存活率。

3 讨论

细菌生物膜促进结肠癌发生发展的作用逐渐清晰，其机制可能通过肠菌代谢产物或免疫微环境的调节发挥[5-11]。F.n在介导结肠癌进展和免疫微环境改变中有重要作用[21,27]， 也有报道[6,20]F.n 广泛存在于牙菌斑和肠黏膜附着的细菌生物膜中。但F.n 细菌生物膜在免疫细胞（如巨噬细胞）浸润和结肠癌患者预后中的作用尚不清晰。本研究结果提示生物膜在肠癌组织中的存在与否和肿瘤相关巨噬细胞M2 型极化比例相关，且和术后化疗患者耐药复发相关；体外细胞实验结果显示生物膜状态下F.n.的代谢物更能降低化疗药物（LOHP/5-FU）对肠癌细胞的药物毒性。M2型巨噬细胞可能通过白介素-6（interleukin-6，IL-6）诱导肠癌细胞的耐药[14,27]，本研究发现生物膜状态下F.n.的代谢物对巨噬细胞IL-6 诱导水平更高。细菌生物膜作为一种特殊的集群结构，其内个体依赖于效应分子相互交流，在药物反应、毒力因子和代谢产物等方面发生改变，从而产生更强的生存适应性和致病性。本研究检测发现生物膜状态下，F.n.生物膜形成力增强，菌体本身耐药性提高，且群体效益相关基因表达发生变化。因此，黏附分子阻断剂、胞外聚合体抑制剂，以及DNA 结合蛋白家族（DNA binding protein，DNABII）单抗等靶向生物膜形成及存在过程的分子制剂[4]，或能成为细菌生物膜阳性肠癌患者的辅助治疗。

本研究初步揭示了细菌生物膜在巨噬细胞极化诱导和结肠癌化疗耐药中的作用，提示细菌生物膜检测对化疗效果的预示和清除生物膜对改善肠癌患者预后的潜在意义。但目前研究未对发挥关键作用的代谢产物组分进行分析 ，也未能对F.n 生物膜 - 肿瘤相关巨噬细胞 - 结肠癌细胞相互作用的内在机制做深入研究，有待今后进一步探索。

参·考·文·献

[1] Wong SH, Yu J. Gut microbiota in colorectal cancer: mechanisms of action and clinical applications[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16(11): 690.

[2] Sears CL, Garrett WS. Microbes, microbiota, and colon cancer[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(3): 317-328.

[3] Louis P, Hold GL, Flint HJ. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer[J]. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(10): 661.

[4] Koo H, Allan RN, Howlin RP, et al. Targeting microbial biofilms: current and prospective therapeutic strategies[J]. Nat Rev Microbiol, 2017, 15(12): 740.

[5] Li S, Konstantinov SR, Smits R, et al. Bacterial biofilms in colorectal cancer initiation and progression[J]. Trends Mol Med, 2017, 23(1): 18-30.

[6] Tytgat HLP, Nobrega FL, van der Oost J, et al. Bowel biofilms: tipping points between a healthy and compromised gut?[J]. Trends Microbiol, 2019, 27(1): 17-25.

[7] Tomkovich S, Gharaibeh RZ, Dejea CM, et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer[J]. mSystems, 2020, 5(1): e00451-19.

[8] Tomkovich S, Dejea CM, Winglee K, et al. Human colon mucosal biofilms from healthy or colon cancer hosts are carcinogenic[J]. J Clin Investig, 2019, 130: 1699-1712.

[9] Johnson CH, Dejea CM, Edler D, et al. Metabolism links bacterial biofilms and colon carcinogenesis[J]. Cell Metab, 2015, 21(6): 891-897.

[10] Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers[J]. PNAS, 2014, 111(51): 18321-18326.

[11] Dejea CM, Fathi P, Craig JM, et al. Patients with familial adenomatous polyposis harbor colonic biofilms containing tumorigenic bacteria[J]. Science, 2018, 359(6375): 592-597.

[12] Chanmee T, Ontong P, Konno K, et al. Tumor-associated macrophages as major players in the tumor microenvironment[J]. Cancers, 2014, 6(3): 1670-1690.

[13] Kang JC, Chen JS, Lee CH, et al. Intratumoral macrophage counts correlate with tumor progression in colorectal cancer[J]. J Surg Oncol, 2010, 102(3): 242-248.

[14] Yin Y, Yao SR, Hu YL, et al. The immune-microenvironment confers chemoresistance of colorectal cancer through macrophage-derived IL6[J]. Clin Cancer Res, 2017, 23(23): 7375-7387.

[15] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018[J]. CA: a Cancer J Clin, 2018, 68(1): 7-30.

[16] Chen WQ, Zheng RS, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA: A Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-132.

[17] Siegel RL, Miller KD, Goding Sauer A, et al. Colorectal cancer statistics, 2020[J]. CA: A Cancer J Clin, 2020, 70(3): 145-164.

[18] Marin JJG, Sanchez de Medina F, Castaño B, et al. Chemoprevention, chemotherapy, and chemoresistance in colorectal cancer[J]. Drug Metab Rev, 2012, 44(2): 148-172.

[19] Goetz MP, Grothey A. Developments in combination chemotherapy for colorectal cancer[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2004, 4(4): 627-637.

[20] Drewes JL, White JR, Dejea CM, et al. High-resolution bacterial 16S rRNA gene profile meta-analysis and biofilm status reveal common colorectal cancer consortia[J]. Npj Biofilms Microbiomes, 3(1): 1.

[21] Chen T, Li Q, Wu J, et al. Fusobacterium nucleatum promotes M2 polarization of macrophages in the microenvironment of colorectal tumours via a TLR4-dependent mechanism[J]. Cancer Immunol Immunother, 2018, 67(10): 1635-1646.

[22] Mima K, Sukawa Y, Nishihara R, et al. Fusobacterium nucleatum and T cells in colorectal carcinoma[J]. JAMA Oncol, 2015, 1(5): 653-661.

[23] Yu T, Guo FF, Yu YN, et al. Fusobacterium nucleatum promotes chemoresistance to colorectal cancer by modulating autophagy[J]. Cell, 2017, 170(3): 548-563.e16.

[24] Swidsinski A, Weber J, Loening-Baucke V, et al. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(7): 3380-3389.

[25] Rizzato C, Torres J, Kasamatsu E, et al. Potential role of biofilm formation in the development of digestive tract cancer with special reference to Helicobacter pylori infection[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 846.

[26] Kim M, Vogtmann E, Ahlquist DA, et al. Fecal metabolomic signatures in colorectal adenoma patients are associated with gut microbiota and early events of colorectal cancer pathogenesis[J]. mBio, 2020, 11(1):e03186-19.

[27] Kostic AD, Chun E, Robertson L, et al. Fusobacterium nucleatum potentiates intestinal tumorigenesis and modulates the tumor-immune microenvironment[J]. Cell Host Microbe, 2013, 14(2): 207-215.