糖尿病肾脏疾病中医证候标志物研究的必要性和可行性分析

李平 赵海玲

摘要 糖尿病肾脏疾病（DKD）是尿毒症的主要原发病，但现代医学诊治具有其局限性;“辨证论治”DKD具有一定的优势，然而，其病情评估和疗效判断的客观性和可重复性受到质疑。表现于外的中医证候与内在疾病本质有着必然的联系，代谢组学整体性特点可以发现DKD中医证候对应的代谢标志物。因此，基于代谢组学技术，开展DKD诊断代谢标志物研究具有十分重要的科学意义和临床应用价值。本文通过探讨DKD中医证候的规范化和客观化研究的瓶颈问题，论述基于高灵敏度、高分辨率UPLC-Q-Orbitrap质谱分析，运用计算机“大数据+深度学习”方法，发现DKD中医证候代谢标志物的必要性和可行性，为DKD的辨证分型提供可量化、可重复的客观依据，提高DKD辨证论治的科学性。

关键词 糖尿病肾脏疾病;中医证候;代谢标志物;UPLC-Q-Orbitrap质谱技术;深度学习方法

Abstract Diabetic kidney disease （DKD） is the main cause of uremia，but western medical treatment of DKD has its limitations.“Syndrome Differentiation and Treatment” of Chinese medicine （CM） has certain advantages for DKD treatment.However，their objectivity and reproducibility of disease assessment and efficacy judgment were questioned.Traditional Chinese Medicine （TCM） syndromes are inevitably related to the intrinsic nature of the disease，the holistic characteristics of metabolomics are helpful to find the metabolic markers corresponding to TCM syndromes of DKD.Therefore，it is of great scientific significance and clinical application value to carry out the study of DKD diagnostic metabolic markers based on metabonomic techniques.In this study，we discussed the bottleneck problem of TCM syndrome normalized and objective study of DKD，and expounded the necessity and feasibility of TCM Syndrome markers of DKD based on high-sensitivity and high-resolution UPLC-Q-Orbitrap mass spectrometry analysis method and “big data and deep learning” technique.In order to provide a quantifiable and repeatable objective basis for DKD syndrome differentiation， and improve the scientific nature of DKD syndrome differentiation.

Keywords Diabetic kidney disease; Traditional Chinese medicine syndrome; Metabolic markers ; UPLC-Q-Orbitrap Mass Spectrometry technique; Deep learning method

中圖分类号：R256.5;R255.4;R259文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.001

糖尿病肾脏疾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）主要微血管并发症之一，在全球患病率高、危害严重[1]，是DM患者致死、致残的主要原因。欧美国家大样本DM队列研究报道20%～40%的DM患者可发展为DKD[2]。我国已成为全球DM第一大国，其中2型糖尿病患者DKD患病率为10%～40%[2-3]。研究显示，我国DKD的知晓率不足20%，治疗率不足50%[4]。对2010—2015年我国三甲医院住院人群进行的慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）病因调查中发现：自2011年起，DM相关肾脏疾病已成为导致CKD发生的首要原因[5]，但值得注意的是，DM相关肾脏疾病并非确诊的DKD[6]。最新研究发现，2型糖尿病行肾活检患者中DKD患者仅占59.8%，其他包括非糖尿病肾脏疾病（Non-diabetic Kidney Disease，NDKD）为34.5%，DKD合并NDKD患者为5.7%[7]。肾穿刺活检是诊断DKD的金指标，但由于其是一项有创性的检查，有一定风险及禁忌证，并十分受限于各地的医疗条件，故在临床实践中多以临床特征诊断DKD。所以有些NDKD患者本可以通过激素或免疫抑制剂等药物治疗，但因为被误诊为DKD而局限于使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻滞剂，从而影响疾病的预后。因此，开展DKD无创诊断生物标志物研究是DKD临床诊疗中亟待解决的关键科学问题之一。

1 开展DKD中医证候的规范化和客观化研究是当前中医药诊治DKD有待突破的瓶颈问题

DKD研究过程中存在2个瓶颈问题：其一是早期隐匿起病，往往容易忽视;患者出现临床显性蛋白尿，疾病进展迅速，缺乏有效减少蛋白尿和改善肾功能的药物，迅速进展至终末期肾病为普通CKD的十几倍[4]。在国家973课题资助下，我们课题组开展中医证候学研究发现：DKD中医证候学特点是本虚标实，气阴两虚是DKD的核心病机，瘀血贯穿于疾病的始终[8-10]。临床应用具有“益气养阴、活血化瘀”作用的复方中药—糖肾方，可以减少DKD临床显性蛋白尿，改善肾功能[11-12]。这一结果亦得到基础研究的证实[13-15]。辨证论治是中医治疗的精华所在，证候是中医辨证论治的核心和关键。而中医对证候的认识大多是主观的和直观的，极大地限制了中医学的发展和推广。我们课题组前期利用代谢组学方法对DKD不同分期与DM患者血液标本分析研究发现：随着DKD疾病进展，磷脂类代谢物呈下降趋势;嘌呤/嘧啶核苷类代谢物呈上升趋势。这与中医辨证从阴虚证向气虚证转化，进而转化为气阴两虚证的变化趋势具有良好相关性这些结果提示：表现于外的中医证候与内在疾病的本质有着必然的联系。借助现代组学技术，深入开展DKD气阴两虚证代谢标志物挖掘，不仅有助于DKD无创诊断，亦为DKD中医精准辨證论治提供客观依据。

2 糖尿病肾脏疾病中医证候标志物研究的必要性和可行性分析

鉴于DKD肾组织活检的有创性，越来越多的学者致力于寻找无创的DKD诊断和疾病进展生物标志物。特别是高通量多种组学技术的兴起将DKD诊断生物标志物研究推向了前所未有的高潮，其中高分辨代谢组学技术在DKD潜在生物标志物筛选中具有显著优势，可能是实现DKD患者诊断与进展监测的重要手段。

2.1 筛选特异性生物标志物是DKD无创诊断研究的关键问题 DKD生物标志物筛选是近年来研究者关注的热点之一。目前DKD生物标志物主要包括3大类：传统生物标志物、肾脏结构损伤和发病机制相关生物标志物、以及系统生物学方法发现的生物标志物。传统DKD生物标志物包括尿微量白蛋白以及血清肌酐和胱抑素C等肾小球滤过率相关分子，至今仍广泛应用于DKD临床诊断。若肾小球滤过率（Glomemlar Filtration Rate，GFR）低于60 mL/（min·1.73 m2）和（或）尿白蛋白/肌酐比值（Urinary Albumin/Creatinine Ratio，UACR）高于30 mg/g，持续超过3个月，可临床诊断为DKD。然而，有些DKD患者没有UACR的改变，或DM患者合并的肾脏损害可能由其他NDKD引起[4]。

肾脏结构损伤和发病机制相关的DKD生物标志物研究发现：糖尿病引起的高血糖可使肾脏结构和细胞受损，肾小球滤过屏障功能缺陷，尿液中出现生理情况下不能透过屏障的白蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白等;足细胞损伤使DKD患者尿足细胞表面蛋白Nephrin、Podocalyxin等水平与蛋白尿正相关[16-17];肾小管上皮细胞受损脱落，DKD患者尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）[18]、肾损伤分子1（KIM-1）等标志蛋白含量增加[19]。基于发病机制的DKD诊断生物标志物包括与肾脏炎性反应相关的血液TNF-α和尿液MCP-1等[20]，与氧化应激有关的尿液8-OHdG等[21]。但上述分子缺乏特异性，也可能与NDKD导致肾脏病理损伤有关，如IgA肾病和狼疮性肾炎患者尿液中同样存在高浓度的Nephrin等足细胞蛋白[22-23]。

近年来，基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等高通量系统生物学技术迅速发展，为DKD新的生物学标志物筛选提供了更好的技术平台。蛋白质组学发现DKD患者尿液中有60余种蛋白水平明显改变;443种尿液蛋白肽段中约50%含有Ⅰ型胶原α1和Ⅲ型胶原α1片段，提示这2种蛋白肽段是DKD潜在分子诊断标志物[24-25]。基因组学发现DKD患者尿液外泌体中miRNA-145、miRNA-130a等22个miRNA表达水平差异有统计学意义[26]。

代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的延伸，能够测绘生物样本中代谢物的动态变化，成为筛选DKD这一代谢性疾病生物标志物的强有力工具。代谢组学通过检测内源性代谢产物在扰动下（如疾病发生或药物作用后）的变化，对生物系统进行整体及其动态变化规律的研究，已被广泛应用于疾病诊断、医药研制开发等领域[27]。糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，DKD早期虽无特异的临床症状，已有研究表明在明显器质性病变之前，DKD患者体内的某些相关代谢物已经发生了变化[28]。已有学者利用DKD患者血液或尿液样本开展代谢组学研究，发现了三羧酸循环代谢产物、氨基酸代谢、脂质代谢、尿素循环和核苷酸代谢产物与DKD进展密切相关[29-31]。因此，基于代谢组学技术，开展DKD代谢标志物研究具有十分重要的科学意义和临床应用价值。

2.2 UPLC-Q-Orbitrap质谱技术和深度学习方法为DKD代谢标志物研究提供了新的平台 随着高分辨质谱技术的发展，新型静电场轨道阱（Orbitrap）质谱具有高分辨率、高质量精度、动态范围宽、质量范围广等优势，并克服了其他高分辨质谱如傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱和飞行时间（TOF）质谱的尺寸大、维护与操作复杂等缺点，可以同时提供定性和定量分析;再者，四极杆-Orbitrap（Q-Orbitrap）在线性离子阱-Orbitrap（LTQ-Orbitrap）质谱基础上发展而来，具有更强的定量能力;加上仪器配置的数据库能够实现未知化合物的鉴定，因此该技术可为代谢组学的研究提供了更加强大的技术支持[32-33]。近年来，UPLC-Q-Orbitrap质谱技术已被应用于多项基础研究[34-35]，利用高分辨、高精度的UPLC-Q-Orbitrap质谱技术开展DKD代谢组学研究，是发掘DKD特异代谢标志物的重要研究方向。

“深度学习”方法是开启大数据时代的钥匙。庞大的临床大数据改变了基于概率论和数理统计的传统数据科学，促进了数据分析方法的创新，尤其是“深度学习”，被业界视为是开启大数据时代的钥匙。深度学习是一种“数据驱动”技术，旨在研究如何从数据中自动提取多层特征表示，建立、模拟人脑进行表示学习和解释数据，它具有强大的数据自动特征提取、复杂模型构建以及图像处理能力，非常适合处理医疗大数据分析所面临的问题。以“大数据+深度学习”的技术融合为切入点，通过数据驱动的方式，建立、模拟人脑从数据中学习表示并逐层转换为更高层更抽象的表示，转变传统基于“假设驱动”的医学研究趋势向“数据驱动”方向发展，为实现DKD气阴两虚证的精准辨证提供了先进的技术保证。

2.3 DKD气阴两虚证代谢标志物研究有望为DKD精准辨证提供客观依据 对于DKD证候的认识，我们课题组从既往名老中医经验、专家问卷调查，到大量的临床研究和文献数据挖掘，运用聚类分析、主成分分析和因子分析等数理学方法以及“证素辨证”等研究与验证，各期证候分布符合从气阴两虚逐渐发展至阴阳俱虚的过程，血瘀证贯穿疾病始终[36]。通过对近30年来中医药治疗DKD的1 464篇临床RCT文献进行了证候频次的回顾性研究，发现频次大于20%的证候依次为血瘀（89.9%）、气虚（83.4%）、阴虚（66.2%）、肾虚（48.5%）、肝郁（41.8%）、脾虚（31.6%）和湿浊（21.8%）。在此基础上，又通过350例临床病例研究，确定DKD患者主要证候为气虚证和阴虚证。然而，临床证候不是孤立的，单纯气虚血瘀证与阴虚血瘀证是很少见的，气阴两虚夹瘀证是DKD主要证候，也是中医药治疗DKD的最佳时机。由此，发现DKD气阴两虚证代谢标志物对DKD辨证论治十分重要。

近年来，诸多学者通过探索现代医学指标与DKD中医证候的相关性，实现辨证指标的量化，以期为DKD中医辨证论治提供客观依据。研究表明，DKD患者中医证候与血肌酐、胱抑素C、尿蛋白等指标密切相关[39]。按照阴虚燥热证、气阴两虚证、脾肾气虚证、阴阳两虚证顺序，DKD患者血清IV型胶原和同型半胱氨酸水平逐渐增多，验证了DKD本证从阴虚、气虚到阳虚的演变。然而上述研究仅局限于DKD常规理化指标与中医证候的关系，无法全面解析DKD中医证候的生物学基础。代谢组学整体性特点与中医药理论的整体观和辨证论治相吻合，是研究中医证候本质的最佳方法之一。

一直以来，我们和其他研究者利用代谢组学方法对DKD证候研究进行了有益探索。有研究者利用2型糖尿病、糖尿病视网膜病变、DKD患者开展血清和尿液代谢组学研究，发现了DKD气阴两虚证相关的差异代谢物主要涉及氨基酸代谢、糖代谢、胆固醇代谢、脂代谢等[37]。另一项代谢组学研究筛选出3种2型DKD III期气阴两虚证潜在生物标志物：磷脂酰甘油、鞘磷脂和溶血磷脂酰乙醇[38]。在国家973课题和国家自然科学基金项目的资助下，我们与清华大学罗国安教授团队曾运用磷脂[39]、脂肪酸[40-41]、嘌呤嘧啶[42]和硫醇氨基酸等定量代谢组学方法发现了包括磷脂酰胆碱PC792与PC802、磷脂酰乙醇胺PE750和PE742等4个磷脂类代谢标志物，S-腺苷同型半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸等4个硫醇氨基酸类代谢标志物，以及肌酐、尿嘧啶核苷、肌苷、肌氨酸等4个嘌呤嘧啶类代谢标志物共12个与DKD气阴两虚证相关的潜在代谢标志物。

3 目前存在的问题与展望

迄今為止，DKD代谢标志物研究均为小样本探索性研究，并且所纳入病例大多基于临床特征诊断，而非经肾活检明确诊断的DKD，结果准确性难以保证。益气养阴作为DKD主要治疗原则在业内达成共识，然而病情评估和疗效判断的客观性和可重复性受到质疑，因此，影响了药物在临床中的治疗效果。表现于外的中医证候与内在疾病本质有着必然的联系，代谢组学整体性特点可以发现DKD气阴两虚证对应的代谢标志物，有助于提高DKD辨证论治的准确性和临床疗效。因此，基于高灵敏度、高分辨率代谢组学研究方法，结合计算机“大数据和深度学习”技术，发现并验证DKD疾病以及DKD气阴两虚证的代谢标志物，进一步将数据变为证据，将为DKD的辨证分型提供可量化、可重复的客观依据，有助于提高DKD辨证论治的科学性，为阐明该证候的物质基础提供重要依据。

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（2020-08-01收稿 責任编辑：王明）