重组人Rab17通过调节STAT3/HIF-α/VEGF信号通路影响非小细胞肺癌增殖和侵袭

姚菲菲 王富霞 李增艳

NSCLC的诊断和治疗技术在不断提高，但肺癌患者的总生存率并未显著提高，主要由于患者早期就诊率低，确诊时大多已处于晚期阶段[1]。Rab17是近年来的由人染色体2q32-q37或18q2lq22编码的Rab GTP酶家族的一员，与其他Rab蛋白不同，它主要在富含上皮细胞的器官中表达[2]，在调节跨细胞转运中发挥重要作用[3]。上皮细胞的极性丧失被认为与癌症的进展息息相关，在乳腺癌从癌前病变逐渐发展至浸润性癌的过程中，伴随着上皮极性的逐渐丧失[4]。目前研究显示Rab25的表达降低可促卵巢癌、乳腺癌和皮肤鳞状细胞癌的进展，提示Rab25在多种上皮性肿瘤中发挥一定作用[5-7]。Rab17是第一个被鉴定出来的上皮细胞特异性小GTP酶，随着上皮极性的丧失其表达水平逐渐降低[2]，并有研究显示Rab17水平降低可增加肝细胞癌的侵袭性[8]。目前在NSCLC中的研究较少，本文主要探讨Rab17在NSCLC细胞中的表达水平，对细胞增殖和侵袭的影响及可能的作用机制。

资料与方法

一、实验材料

正常人支气管上皮细胞Bease-2B和NSCLC细胞系A549、H460、HCC827均购于上海细胞生物学研究所；RPMI1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、MTT粉末、多聚甲醛、结晶紫、显影剂和Giemsa染料等购于北京鼎国有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和lipofeetamine 2000购于日本TaKaRa公司；Transwell实验的小室和迁移试验中的小室均购于美国Corning公司；anti-VEGF、anti-STAT3、anti-p-STAT3、anti-HIF-1α、anti-β-actin和辣根过氧化物酶标记的二抗均购于Cell Signal公司；Rab17质粒由广州锐博生物有限公司合成；BCA蛋白定量试剂盒购于江苏碧云天有限公司。

二、实验方法

1 qRT-PCR实验 按照Trizol试剂说明提取细胞中的总RNA，紫外分光光度计检测样品纯度，合格的样本反转录为cDNA。50μl PCR反应体系，94℃，5min，然后 94℃，1min，退火40s，72℃，50s设置30个循环，72℃，7min。Rab17上游引物序列为5′-GTGGGCAACAAGACGGACCT VAG-3′、下游引物序列为5′-CTCGCGGGCC CCTTGT TCAG-3′, GAPDH上游引物序列为5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′、下游引物序列为5′-TGGTGAAGACGCCAGTG GA-3′。cDNA采用BIO-RAD CFX96系统进行实时定量PCR检测 Rab17的表达，以GAPDH作为内参。每个待测基因设6个复孔，数据通过BIO-RAD CFX96系统进行处理，按照公式RQ=2-ΔΔCT计算各组间的倍数关系。

2 细胞培养及转染实验 A549细胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素培养基中培养，放置37℃、5%CO2的恒温箱中，待细胞密增生长到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期的细胞进行转染实验。A549细胞以104个/孔的密度接种于6孔细胞板，常规培养24h，细胞融合度约为70%，将A549细胞随机分为Rab17组(转染Rab17质粒)、NC组(转染阴性对照质粒)、Crontrol组(未转染质粒)，按照脂质体lipofeetamine 2000说明书步骤操作，转染6h后，更换新鲜培养基，继续培养48h，收集各组细胞，qRT-PCR和Western blot 检测转染效果。

3 Western blot实验 收集Rab17组、NC组、对照组细胞加入蛋白裂解液，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白浓度，每个样本定取30 μg蛋白，沸水煮变性。制作10%的分离胶和5%的浓缩胶，加入蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜上。根据maker和目的蛋白分子量大小切取适当大小的膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h、滴加anti-Rab17抗体(1 ∶1000)在4℃冰箱中过夜孵育。采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。滴加二抗(1 ∶4000)室温孵育1h，采用TBST溶液清洗3遍，每次10min。配置一定量的显影液，均匀滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝胶成像系统中拍照。

4 MTT实验 Rab17组、NC组和Crontrol组细胞以每孔2×103的密度接种于96孔板中，接种后每12h检测一次，每个检测时间点设置6个平行孔，20 μL MTT溶液加入检测孔中，放置恒温箱中继续孵育4h。然后去除上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，震荡5 min使细胞充分裂解，然后用酶标仪检测570nm处的吸光度值(OD)，OD值与活细胞的数量成正比。

5 软琼脂集落形成实验 Rab17组、NC组和Crontrol组细胞以每皿100万的密度接种于60 mm的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱里培养14 d，用Giemsa液染色15 min；在倒置显微镜下观察并计数所形成的克隆(≥50个细胞计为克隆)。

6 迁移和侵袭实验 Rab17组、NC组和Crontrol组细胞用无血清培养基悬浮以2×104的密度接种于小室里面(迁移实验的小室不含有基质胶，侵袭实验的小室含有基质胶)。在小室下部加入500 μL含有10%血清的培养基，孵育48h。取出小室放入多聚甲醛中固定10 min，然后至于0.1%结晶紫中染色30 min。用棉签轻轻擦去小室上部未发生迁移或侵袭的细胞，置于显微镜下，每个孔从上至下选择5个视野拍照。

三、 统计分析

结 果

一、 Rab17在正常人支气管上皮细胞和NSCLC细胞中的表达情况

NSCLC细胞A549、H460和HCC827中Rab17 mRNA的相对表达水平均低于正常人支气管上皮细胞Bease-2B，P<0.001。Rab17在NSCLC细胞中表达与Bease-2B细胞相比均较弱，A549细胞中的表达水平最低(见图1)。

图1 Rab17在NSCLC细胞中表达减弱

二、 Rab17质粒转染至A549细胞中使其表达增加

Rab17质粒转染至A549细胞中，嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株，NC组细胞Rab17 mRNA的相对表达水平与对照组相比无差异，Rab17组细胞Rab17 mRNA的相对表达水平高于对照组和NC组，P<0.001。对照组和NC组Rab17的蛋白表达水平无明显差异，Rab17组Rab17的蛋白表达水平明显高于对照组和NC组，Rab17质粒成功转染至A549细胞中(见图2)。

图2 Rab17质粒转染至A549细胞

三、 Rab17对细胞增殖的影响

Rab17组细胞在培养72h时的OD值小于Control和NC组，Rab17组细胞培养14d后形成的集落数显著少于Control和NC组(见图3)。

图3 Rab17抑制A549细胞的增殖

四、 Rab17对细胞迁移和侵袭的影响

Rab17组细胞发生迁移和侵袭的细胞数明显少于Control和NC组(见图4)。

图4 Rab17减弱细胞迁移和侵袭能力

五、 Rab17抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信号通路传导

Rab17组细胞STAT3蛋白表达水平与Control组和NC组相比无明显差异，p-STAT3、HIF-α和VEGF蛋白的表达水平与Control组和NC组相比有所减弱(见图5)。

图5 Rab17抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信号通路传导

讨 论

Rab家族的小GTP酶是膜运输和膜靶向的关键调节剂，该家族中有60多个成员已被鉴定出在人类中具有特殊作用，例如Rab5参与早期内吞作用，Rab7参与晚期内吞途径和蛋白质降解，而Rab11调节蛋白质循环[9]。另外Rab-GTPase家族成员对膜表面离子通道具有调节作用，参与许多细胞生物学行为，其中包括细胞极性消失、细胞侵袭和转移等[10-11]。本研究结果显示，Rab17在NSCLC细胞系中表达水平降低，将Rab17质粒转染至A549细胞后可显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。在肝细胞癌中Rab17的下调在体外和体内试验中均可显著促进细胞的致癌性，如增强细胞增殖、集落形成、侵袭和迁移和促进移植瘤的增殖及血管生成[12]。

VEGF-A被认为是NSCLC发病机理中的主要旁分泌介质，STAT3和HIF-1α为调节VEGF的主要转录因子，在各种癌症中表达上调，且与患者的临床预后不良相关[13-15]。STAT3是确定的致癌基因，可通过调节细胞周期蛋白D1和Bcl-2促进细胞增殖和存活，通过调节E-钙粘蛋白，MMP-9诱导肿瘤侵袭和转移，通过靶向VEGF和HIF1α表达，促进血管生成等多种生物学作用[16-17]。VEGF和HIF-1α作为STAT3的重要转录靶标，是重要的促血管生成因子[18]。本研究结果显示Rab17过表达可减弱VEGF的蛋白表达水平，这表明Rab17可以通过抑制VEGF信号传导来抑制血管生成。此外，Rab17可以通过抑制NSCLC细胞中的HIF-1α表达来抑制STAT3信号通路。综上所述，Rab17在NSCLC细胞中表达水平降低，Rab17的过表达通过抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信号通路传导，进而抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，Rab17有望成为治疗NSCLC的潜在靶点。