应用分子标记辅助选育香型优质稻九香粘

罗世友，胡兰香，熊焕金，吴小燕，陈明亮，邓 伟，陈大洲，肖叶青

(江西省农业科学院 水稻研究所/国家水稻改良工程中心南昌分中心/水稻国家工程实验室,江西 南昌 330200)

香稻是一种自身含有香味物质，其香味能够被人识别出来的特种稻。在国际市场上香米价格高出普通稻米2～3倍，印度的巴斯马蒂香米和泰国茉莉香米正是因其独特的香味而成为世界上最大宗的出口大米品种。江西省气候温暖，雨量丰富，无霜期长，属中亚热带湿润季风气候区，特别适合种植水稻。全省水稻产量占粮食总产的90%以上，是1949年以来全国唯一不间断输出稻米的省份。根据国家水稻数据中心的统计[1]，自1985年实施品种审定以来，截至2019年，江西省农作物品种审定委员会共审定水稻品种948个。其中，赣晚籼31号是通过审定的第一个常规香稻品种，其谷粒具有茉莉香味。其后陆续审定了总共不到10个常规香稻品种，主要有2个方面的原因：一是为了解决我国的温饱问题，长期以来对新品种的评价审定主要以产量为主要指标，忽视了品种的营养、口感等品质性状，加上水稻品种的品质与产量一直是一对很难调和的矛盾，导致审定的香稻品种极其少。二是水稻的香味受第8号染色体上的隐性基因Badh2的调控，在选育过程中很容易丢失；杂交稻中只有不育系和恢复系同时携带香味基因，所有稻米才会有香味；不育系或恢复系只有一个携带香味基因，稻米的香味处于分离状态，只有小部分稻米有香味，这增加了选育难度。随着现代分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择技术已经得到了广泛的应用，其通过利用与性状基因紧密连锁的标记进行检测、追踪目标基因，能够在品种选育的早期世代获得基因的纯合体，这有助于提高育种效率，缩短育种年限，加快育种进程。

赣晚籼30号(原名923)是江西省农业科学院水稻研究所于2000年育成的一个晚籼优质稻品种[2]。923的分蘖力强，穗小结实率高，米饭有嚼劲，清香软滑，外观和口感与泰国大米相媲美，以至于出现用923大米冒充泰国香米进行销售的现象。针对其产量偏低的问题，笔者从923的自然杂交后代中选育出了高产优质品种赣晚籼37号(原名926)[3]。926于2005年通过江西省农作物品种审定委员会审定，其米质达国标3级，外观和食味品质与923相当，被列为2017年的江西省主推品种。随着人民生活水平的不断提高，普通消费者对日常消费的口粮品质提出了更高要求，香米因其口感好而成为市场追捧的对象。为了适应市场和消费者的需求，保持923品种的外观和食味品质，增加香味特性，提高产量水平，笔者选用香稻品种美香占2号作母本与923杂交，通过分子标记辅助选择携带香味基因的单株，结合农艺性状的筛选，最终育成香稻品种九香粘。九香粘于2016年申报国家植物新品种权保护，2018年1月获得授权(品种权号：CNA20160965.1)。2016年4月通过江西省农作物品种审定委员会审定(审定编号：赣审稻2016001)。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

923是一个优质晚籼稻品种，其分蘖力强，直链淀粉含量14.9%，米饭有韧性耐咀嚼，外观和口感都很突出。美香占2号是广东省农科院水稻所育成的优质香稻品种，具有株型好、分蘖力较强、结实率较高、熟色好、谷粒较小的特点。

1.2 分子标记的检测

水稻叶片总DNA的提取采用CTAB法，稍加修改。具体方法：在装有3 cm长新鲜叶片的2 mL离心管中加入600 μL的CTAB提取液，用高通量组织研磨仪研磨；将离心管移入65 ℃的水浴锅中水浴30 min；在通风橱往离心管中加入600 μL的氯仿，混匀5～10 min，在离心机上用12000 r/min转速离心6 min，吸取上清液200 μL至准备好的1.5 mL离心管；在1.5 mL离心管中加入400 μL的预冷无水乙醇，混匀后放-20 ℃冰柜冷藏30 min，然后用12000 r/min转速离心8 min，倒去无水乙醇，晾干；加ddH2O 200 μL溶解，-20 ℃冷藏备用。

PCR反应体系为10 μL,其中模板DNA 1 μL，引物 1 μL(上游引物和下游引物各0.5 μL)，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，10×PCR Buffers 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 6.55 μL。PCR反应程序：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s，35个循环；72 ℃、10 min。采用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳显影。Badh2基因的连锁标记[4]：Badh2-E7上游引物序列：5′-GGTTGCATTTACTGGGAGTT-3′；下游引物序列：5′-CAGTGAAACAGGCTGTCAAG-3′。所有试剂及药品均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 稻米品质性状的检测

参照农业部标准《食用稻品种品质》(NY/T 593─2013)方法，测定水稻的出糙率、精米率、整精米率、粒长、长宽比、垩白粒率、垩白度、胶稠度、直链淀粉含量等主要稻米品质指标。

1.4 产量测算方法

水稻成熟后适时收割，在太阳下晾晒3 d，去除瘪粒和空粒，测量鲜重，采用稻谷水分快速测量仪测量晒干的稻谷含水量，根据公式：干重=[(1-鲜重含水量)×鲜重/(1-标准含水量)]，换算成干重，根据实割的稻田面积计算水稻的产量。

2 结果与分析

2.1 选育经过与方法

2008年夏季中稻应用美香占2号作母本与923构建组合美香占2号/923，同年冬季海南种植F1，剔除假杂株后混收种子。2009年秋季南昌晚稻种植F2群体，苗期取叶片检测香味基因，采用系谱法进行熟期、株型和香味选择单株，适当放宽选择标准，多选单株。2009年冬季南繁种植F3株系，淘汰具有显著缺点的株系。2010年秋季晚稻种植F4株系，每个株系种植50株，加大选择压力，在分蘖力强、株型偏紧凑、大穗和熟期稿色好的入选株系中，选择具有香味的单株混收种子。2010年冬季南繁种植F5株系，选综合性状优良的株系混收。2011年秋季晚稻种植F6株系，每个株系种植100株，成熟期混收株系，进行米质品尝，编号117488的株系表现食味口感好，有香味，安排冬季南繁加代繁殖。2012年秋季晚稻进行小区比较试验，并进行移栽和直播试验，表现出产量较高、抗倒性较好，送稻谷进行品质分析，命名为九香粘。

2.2 香味基因的检测

在美香占2号/923组合的F2～F5分离世代的中间材料苗期提取叶片，应用Badh2-E7标记进行辅助选择，标记携带香味基因纯合型的单株，结合农艺性状的考察，确定保留单株留种。检测结果见图1。

P1:美香占2号;P2:923;1～22:分离世代材料。

2.3 主要农艺性状

九香粘为常规香型籼稻品种，茎、叶、糙米均有香味；株型紧散适中，长势繁茂，茎秆较粗壮，株高124 cm，茎秆基部包茎节，分蘖力强，单株10个有效穗以上；叶色较浅，老叶叶尖和叶缘渐黄，剑叶微卷，倒二叶直立，叶下禾，后期落色好；穗大粒多，着粒较密，穗长约24.7 cm；平均每穗总粒数约151.6粒，每穗实粒数127.4粒，结实率84.0%，千粒重26.5 g；平均单穗重3.37 g。九香粘与923的主要农艺性状对比见表1，从表1可以看出，九香粘的株高、结实率和全生育期与923的相当，产量的增加主要是通过增加穗长和每穗总粒数，从而提高单穗重来实现增产的目标。

表1 九香粘与亲本923的主要农艺性状的比较

2.4 主要品质

2015年经农业农村部食品质量监督检验测试中心(武汉)检测：九香粘出糙率80.5%，精米率71.7%，整精米率62.0%，粒长7.0 mm，长宽比3.4，垩白粒率2.3%，垩白度4.6%，胶稠度72 mm，直链淀粉含量15.4%。九香粘与923的品质性状对比见表2。九香粘在选育的过程中主要以923为对照，保留了923的粒型优势，提高了出糙率和胶稠度，米质达国标3级，口感好，有香味。

表2 九香粘与亲本923的主要品质性状对比

2.5 产量表现

2015年区试平均产量为9032.1 kg/hm2，比对照Y两优1号增产0.29%，差异不显著。全生育期132.9 d，比对照Y两优1号长2 d。2012年在永修县燕坊村作一季稻直播试验，平均产量7755 kg/hm2，未倒伏。2013年在江西省南昌县塘南、向塘镇、广福镇、星子县、永修县、宜丰县、抚州和高安基地等地试种，产量接近或超过7500 kg/hm2，高产田块达到9000 kg/hm2(广福镇)，产量表现较为稳定。2014年在江西省农科院高安基地示范试验，人工移栽，经专家测产，产量8076 kg/hm2，未见明显病虫害。在永修县种植1.5 hm2，人工移栽，平均产量8460 kg/hm2，未见稻瘟病；在湖口县种植3.33 hm2，直播栽培，平均产量6930 kg/hm2，高产田块7905 kg/hm2；在宜丰县采取抛秧种植4.5 hm2，平均产量6165 kg/hm2，高产田块8700 kg/hm2，抗病能力强。2015年在德安县试种6.7 hm2，全部直播，6月1日播种，生育期128 d，经县农业局组织专家现场测产，平均产量8904 kg/hm2。

3 小结与讨论

江西省是我国粮食生产的11个主产区之一，长期坚持输出稻米，为保障我国粮食安全作出了重要贡献。在以产量为主要考核指标的水稻品种审定体系下，截至目前，江西省总共审定的常规香稻品种有赣晚籼31号(2002年审定)、赣晚籼39号(2009年审定)、赣晚籼40号(2015年审定)、美香新占(2016年审定)、九香粘(2016年审定)、洪香占(2019年审定)和赣香占1号(2019年审定)。所有常规香稻品种都是进入21世纪以后才审定的，这与我国的国情基本是相吻合的，20世纪的2次绿色革命——矮化育种和杂交稻育种，都是为了满足人民的吃饱问题。随着社会经济的发展，人民生活水平的不断提高，普通消费者对稻米的要求也提高了，不仅要吃饱，而且要吃好。这给水稻育种提出了新的课题，在保证产量的前提下，如何提高稻米品质成了新的研究方向。香味是稻米非常重要的食味品质性状之一，香米因其香味浓郁、口感好而倍受消费者喜爱。

常规香稻品种的选育一般采用系谱选育法，所需育种时间长、效率低。分子标记辅助选择育种是一种通过检测与性状基因紧密连锁的标记达到高效定向选择的目的，结合农艺性状的筛选进行品种培育的方法。目前，该方法广泛应用于水稻的常规稻和杂交稻父母本的培育与改良，已经有一些审定品种主要是通过应用该方法来提高其产量、品质和抗性等综合性状。庄杰云等[5]通过多基因聚合技术将抗稻瘟病基因Pib、Pita，抗白叶枯病基因Xa4、Xa13和优质基因Wx聚合到一起育成恢复系中恢161，配组成杂交稻新组合中优161。彭应财等[6-7]应用福恢838与携带白叶枯病抗性基因Xa21的IRBB21杂交建组，利用分子标记检测和人工接种抗性鉴定相结合，育成高抗白叶枯病的恢复系中恢218。随后育成杂交稻益丰优218和天优2180。吴俊等[8]应用分子标记辅助选择技术，将马来西亚普通野生稻中的增产QTLyld1.1和yld2.1导入9311中，育成高产恢复系R163，继而育成杂交稻组合Y两优7号。柳武革等[9]应用分子标记辅助选择方法将Pi-1和Pi-2两个基因导入荣丰B中，获得改良保持系，然后通过回交转育成抗稻瘟病的安丰A。陈志伟等[10]将抗稻瘟病基因Pi-9导入金山B-1中，回交转育成M20A，通过测配育成杂交早稻M优2155。李金华等[11]利用分子标记辅助选择技术将香味基因(frg)和低直链淀粉基因(wax)导入到天丰B中，然后通过回交转育成优质不育系长泰A，随后配组育成杂交稻长优736。

水稻的香味差异[12]是由Badh2基因的等位变异决定的，与香味有关的水稻品种常常包括其第7外显子8 bp的缺失和3个单核苷酸多态性(SNPs)，或者第2外显子7 bp的缺失。当Badh2基因在编码区或者调控区域发生突变时，能够产生无生物学活性的甜菜碱脱氢酶，导致水稻产生香味。目前，已经有研究者通过利用Badh2基因的紧密连锁标记进行辅助育种培育出了香稻品种。李俊周等[13]利用香稻品种方欣4号与自育的高产抗病品种20106杂交，后经分子标记辅助选择Badh2基因和产量品质性状的筛选，培育出种综合性状好、稳产性好、米质优的香稻品种豫农粳11号。闫影等[14]以南粳46为母本，广陵香粳为父本，采用分子标记辅助选择方法聚合了香味等位基因Badh2-E7和低直链淀粉含量基因Wx-mq，结合直链淀粉含量测定和香味检测，育成了优质早熟香稻新品种沪早香软1号。朱小方等[15]以香型软米水稻青香软粳作为软米基因供体亲本,以香型非软米水稻光明粳2号作为转育亲本,结合软米基因分子标记辅助筛选,成功培育出了香型软米水稻上师大18号。

本研究是以优质稻923为主要受体，通过分子标记辅助选育的方法，将美香占2号携带的香味基因导入其中，结合系谱选育的方法，农艺性状的选择以923为主要参考，定向选择大穗型材料，经江西南昌和海南三亚两地4年的穿梭育种培育成香稻品种九香粘。九香粘表现为产量高、品质优、稻米香、适应性广的特点，2017年作为中国援助非洲刚果(金)的新品种[16]，在当地经过3个示范点种植测产结果，与当地2个品种(Moponga、Jasmine)对照，比Moponga增产21.3%，比Jasmine增产17.6%，增产显著。