甘薯黑斑病菌胁迫对不同甘薯品种抗氧化酶活性及MDA含量的影响

张成玲，孙厚俊，谢逸萍，杨冬静，马居奎

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业农村部 甘薯生物学与遗传育种重点实验室，江苏 徐州 221131)

甘薯黑斑病是由甘薯长喙壳菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)引起的，发生在甘薯苗期、大田期、贮藏期，为害甘薯茎蔓、薯块等，是甘薯重要的病害之一。甘薯黑斑病在全国各大薯区均有发生，每年造成产量损失5%～10%，发病严重年份或地区的产量损失更高。发病甘薯中产生的黑疱霉酮等物质可引起家畜中毒，甚至死亡。用发病薯块进行发酵时，能毒害酵母菌和糖化酶菌，延缓发酵过程，降低酒精产量和质量[1-2]。病原C.fimbriata能侵染牵牛、绿豆、红豆等多种植物，造成了重大的经济损失。为了能更好地防治甘薯长喙壳菌，国内外学者对不同寄主来源病菌的生物学特性、基因型及病菌侵染等方面进行了研究。2013年Simpson首先等对甘薯长喙壳菌进行全基因组测序，研究了该菌的微卫星标记，明确了其种群结构和起源，开发了微卫星标记，以区分甘薯长喙壳菌的物种[3]。随后Li等[4]对中国、日本、澳大利亚和美国的C.fimbriata进行了分析，明确了这些地区来源的病菌具有相同的转录间隔区(ITS)序列，微卫星等位基因变异较小，甘薯与石榴上分离出的病原菌属于同一个生物种，而桉树上的病原菌具有典型亚洲种群特性。Scruggs等[5]利用ITS、TEF和MAT-2序列分析了美国北卡罗来纳州甘薯黑斑病分离株的遗传多样性，发现50株供试菌株均为单一交配型MAT-2，ITS、TEF与MAT-2序列的比对显示，所有分离株在每个位点都是相同的。不同寄主来源的甘薯长喙壳菌对寄主的亲和性不同，芋头菌株和石榴菌株均可在芋头块茎组织表面生长,并最终致其腐烂，表现出亲和反应，但是甘薯菌株接种芋头块茎组织后，表面无菌丝生长，表现出非亲和反应[6]。但来源于甘薯的C.fimbriata对所有甘薯品种均有致病性，但不同品种的抗性表现差异，筛选出了如苏薯9号、徐薯23、渝苏76、鄂薯2号、冀薯99、烟薯18等抗性品种[5,7-9]。利用SSH技术构建甘薯抗黑斑病材料的cDNA文库,明确了muRdrl等抗性基因位点[10]。利用转基因技术，明确了大麦硫蛋白α-hordothionin(αHT)能抑制甘薯长喙壳菌的侵染，显著提高了甘薯的抗性[11]。

病原菌等生物胁迫可诱导植物体活性氧积累，对植物产生伤害，而植物体的保护酶系统，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)相互协调，可清除植物活性氧，降低其对植物的伤害[12-13]。接种甘薯黑斑病菌后，甘薯块根中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高,且抗病品种的酶活力变化速度和峰值均高于感病品种,即不同甘薯品种酶活力变化与甘薯抗病性存在相关性[14]。刘美艳[15]、王景景[16]等测定了高抗黑斑病菌材料“南京-92”和高感材料“烟台-252”块根中绿原酸、总酚的含量、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。抗病品种在黑斑病侵染第1天，PAL活力就迅速提高，且一直保持较高水平，绿原酸含量也迅速提高。感病品种在黑斑病侵染后第3天的PAL活力才显著升高、第5天后迅速下降；高抗品种体内PPO活性及总酚含量比高感品种提高迅速，且持续时间较长。尽管已有不少有关甘薯薯块保护酶等活性变化的报道，但是甘薯黑斑病菌引起甘薯薯苗酶活力变化尚不清楚。本研究从山东潍坊采集到甘薯黑斑病样品，经分离鉴定后，接种到不同甘薯薯苗上，测定并分析了不同接种时间不同甘薯品种叶片SOD和POD活性变化及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，为甘薯薯苗抗逆机理的深入研究、抗性品种的筛选及培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘薯黑斑病菌甘薯长喙壳菌(C.fimbriataEllis et Halsted)为江苏徐州甘薯研究中心从山东潍坊甘薯黑斑病发病薯块上分离得到，命名为WF。将病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28 ℃活化培养7 d后备用。供试甘薯品种为烟薯252、冲绳100(胜利百号)、南京92、徐薯273、徐薯18，均为江苏徐州甘薯研究中心提供。从苗床中剪取生长整齐一致的健壮幼苗，筛选4叶1心，基部茎粗12～13 mm，茎长(20±2)cm，茎节3节的幼苗进行清水培养。培养器为规格500 mL的烧杯，每瓶3株。水培期，每2 d更换1次清水，每次每瓶加300 mL。

1.2 试验设计及接种

待幼苗缓苗后，利用上述培养的病原菌孢子浓度为1×106CFU/mL的孢子悬浮液进行处理30 min，移入清水中继续培养，分别于接种后1、6、24、72、120、168 h采集叶片。每个试验甘薯品种设3次重复，以清水处理为对照。

1.3 抗氧化酶活力的测定方法

POD、SOD、MDA测定试剂盒(微量法)均购自苏州科铭生物技术有限公司。样品冷冻研磨后加入提取液，根据苏州科铭生物技术有限公司试剂盒使用说明，利用Thermo Scientific Multiskan GO酶标仪，测定不同酶在特定波长下吸光值，计算其活性及含量。

1.4 数据统计与分析

实验数据采用Excel 2007软件进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 甘薯黑斑病菌胁迫下不同甘薯品种MDA含量的变化

4个甘薯品种的MDA含量随时间的延长，抗性品种南京92和感病品种烟薯252在120 h(5 d)达到最高值，分别为121.68%和125.89%，随后增长率逐渐减低。而徐薯273、冲绳100和徐薯18的整体增长率逐渐上升，在168 h(7 d)达到最高值。徐薯273和烟薯252接种后72 h的增长率稍低于24 h。处理初期，同一时间处理不同的甘薯品种发现，感病品种的MDA含量增长率明显高于抗病品种，随着抗性趋势的增强，与感病品种增长率差异越明显(图1)。

图1 甘薯黑斑病菌不同处理时间对甘薯叶片MDA含量的影响

2.2 甘薯黑斑病菌胁迫下不同甘薯品种SOD活性的变化

由图2可知，黑斑病菌侵染甘薯后，不同甘薯品种的抗氧化酶SOD活性随时间的推移，其增长趋势不同，抗性品种南京92呈现先上升后下降再上升的趋势，在6 h时增长率最高，达到116.35%；徐薯18在1 h时增长率最高，为89.48%，随后下降，到168 h时呈现上升趋势。徐薯273、冲绳100及烟薯252的增长率整体呈现下降上升再下降趋势。SOD活性随着处理时间的推移，无论是正增长还是负增长，高抗品种南京92的增长率高于其他品种。

图2 甘薯黑斑病菌不同处理时间对甘薯叶片SOD活性的影响

2.3 甘薯长喙壳菌胁迫下不同甘薯品种POD活性的变化

POD普遍存在于高等植物中，能够催化分解由SOD清除自由基所产生的H2O2和过氧化物，在植物生长发育过程中起着重要作用。由图3可知，所有甘薯品种抗氧化酶POD活性随侵染时间的增长而呈现上升趋势，随后增长率下降，除徐薯273在6 h时达到最高值，为302.72%，高于其他甘薯品种，其余品种均在24 h时的增长率最高。同一时间处理不同的甘薯品种，高抗性品种南京92的POD活性的增长率明显高于其他品种，且随着不同品种的抗性变化，其增长率变化也不同。

图3 甘薯黑斑病菌不同处理时间对甘薯叶片POD活性的影响

3 小结与讨论

植物受到胁迫时，活性氧动态平衡被打破，产生大量的活性氧，促使植物脂膜和细胞器膜的严重过氧化，MDA含量升高。为抵御这种胁迫，植物启动膜保护系统又称为抗氧化系统来清除植物体内多余的自由基。POD、SOD酶是植物体内主要的抗氧化酶，其活力的大小及变化趋势反映了植物抗性的强弱[12-13]。

不同甘薯品种薯苗接种甘薯黑斑病菌后，体内MDA及抗氧化酶活力性变化不同。不同甘薯品种接种病菌后，体内MDA含量的变化随时间的增长整体呈现上升趋势，抗性品种南京92和感病品种烟薯252在120 h(5 d)达到最高值，随后下降。处理初期，同一时间处理不同的甘薯品种发现，感病品种MDA增长率明显高于抗病品种，随着抗性趋势的增强，与感病品种增长率差异越明显抗氧化酶SOD随时间推移增长趋势呈现先上升后下降，在72 h时除冲绳100是增长，其余品种均为负增长。SOD随着处理时间推移，无论是增长还是负增长，感病品种增长率低于抗性品种。抗氧化酶POD随时间增长呈现上升趋势，随后增长趋势下降，同一处理时间不同抗性品种，增长率不同，除处理6 h的徐薯273增长率高于其他品种，高抗品种南京92增长率高于其他品种，表现出明显的优势。

综上所述，甘薯黑斑病菌侵染甘薯薯苗后，抗氧化酶活力增长率与品种抗性呈正比，MDA含量变化也反映了甘薯薯苗抗性强弱。