他克莫司血药浓度及相关基因多态性与心脏移植术后新发糖尿病的相关性*

张敏，蔡杰，张菁，袁拥华，韩勇，周红

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022；2.重庆医科大学附属儿童医院药学部，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014；3.华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科，武汉 430022)

移植术后新发糖尿病(new onset diabetes after transplantation，NODAT)是指患者移植前无糖尿病，移植术后发生的糖尿病，是器官移植术后常见的并发症[1]。国际心肺移植学会(international society of heart and lung transplantation，ISHLT)报告显示，心脏移植术后1年内NODAT发病率为23.0%，5年上升至37%[2]。NODAT不仅可导致移植排斥反应、移植物功能减退或丧失，同时也与移植术后的严重感染和早期心血管并发症的发生相关，最终影响患者的长期生存，而且是移植术后的独立致死因素[1-3]。NODAT与性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、丙肝感染、糖尿病家族史、低镁血症和基因易感性等因素相关[1，3-5]。移植术后免疫抑制剂的使用也与NODAT的发生密切相关。目前，器官移植术后常用“钙调磷酸酶抑制剂(calcineurininhibitors，CNIs，主要是环孢素和他克莫司)+霉酚酸制剂(mycophenolic acid，MPA)+糖皮质激素(glucocorticosteroids，GCs)”的三联免疫抑制治疗方案，其中，MPA对血糖几乎无影响，移植术后由于大剂量GCs引起的短暂血糖升高可随着GCs剂量的递减恢复至正常水平[6]。因此，CNIs成为三联免疫治疗方案中引起 NODAT 的主要药物。由于环孢素肝肾毒性大，目前临床主要采用他克莫司进行治疗。然而，他克莫司浓度与NODAT的关系至今仍不明确。因此，笔者在本研究探究他克莫司血药浓度与心脏移植术后NODAT的关系，旨在为降低他克莫司相关NODAT发生风险提供参考。

1 资料与方法

1.1研究对象 连续纳入2016年6月1日—2018年10月31日于华中科技大学同济医学院附属协和医院接受心脏移植手术的患者。纳入标准：①年龄≥18岁；②接受首次心脏移植手术；③门诊随访时间≥12个月；④自愿参与本次研究的患者。排除标准：①心脏移植术前有糖尿病史，降糖药用药史，空腹血糖≥7.0 mmol·L-1，血红蛋白(A1c)≥6.5%患者；②接受联合移植的患者，如心肝联合移植，心肺联合移植等。本研究已获得华中科技大学同济医学院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2资料收集 人口统计学资料和临床资料通过查阅电子病历收集。详细记录患者的以下信息：性别、年龄、BMI、移植术前诊断、血压、血脂、吸烟史、低镁血症[血清镁离子(Mg2+)水平<0.74 mmol·L-1][7]、合并他汀类药物、总胆红素、血清肌酐、他克莫司剂量和浓度、血糖和降糖方案。肌酐清除率的计算采用Cockcroft-Gault公式：肌酐清除率=(140-年龄)×体质量×0.85(女性)÷(72×血清肌酐)[8]。本实验他克莫司浓度为达治疗窗时的浓度，并计算剂量校正浓度(the dose-adjusted tacrolimus trough concentration，C0/D)以排除给药剂量、患者体质量等因素对血药浓度影响[9-10]。C0/D=血药谷浓度/(剂量·体质量-1)[(ng·mL-1)/(mg·kg-1·d-1)]。

1.3免疫抑制方案 所有移植受者均接受三联免疫抑制治疗，包括他克莫司、吗替麦考酚酯和GCs。他克莫司(商品名：普乐可复，日本安斯泰来制药有限公司，进口药品注册证号：H20090692，规格：每粒0.5，1 mg)，起始剂量按0.06～0.08 mg·kg-1·d-1(每间隔12 h给药1次)给药，根据血药浓度监测结果进行剂量调整。吗替麦考酚酯(商品名：骁悉，上海罗氏制药有限公司，进口药品注册证号：H20040552，规格：每粒 0.25 g)，按每次1 g，q12h，初始剂量给药，根据患者耐受性和移植排斥反应发生情况进行剂量调整。醋酸泼尼松(武汉远大制药集团有限公司，批准文号：国药准字H42021886，规格：每片 5 mg)，按1 mg·kg-1·d-1(bid)的起始剂量给药，随后逐渐减量，维持剂量为10 mg·d-1。

1.4基因位点和基因检测 采集患者外周血2 mL，存于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，使用Magen核酸提取试剂盒(广州美基生物技术有限公司)提取DNA。使用分光光度计(Thermo，Inc.，DE，USA)测定浓度和纯度后，将DNA储存在-80 ℃冰箱中。根据已有文献报道，选择4个常见的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点[4，10]：rs2237895、rs5215、rs2276706和rs8450。SNPs采用飞行质谱法进行基因分型(北京六合华大基因科技有限公司)。所有样品一式三份进行分析，并包括阴性和阳性对照以确保结果的真实性。

1.5诊断标准及随访 根据美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA)的诊断标准，NODAT定义为移植术后(≥1个月)出现以下一种或多种情况：①至少2次空腹血糖≥7.0 mmol·L-1；②至少2次随机血糖≥11.1 mmol·L-1；③正在接受饮食控制或降糖药物治疗[11]。诊断NODAT应在移植术后至少1个月，以排除因移植术早期病情不稳定、大剂量使用GCs以及感染等引起的短暂性高血糖[6]。

1.6统计学方法 采用SPSS 19.0版统计软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较使用成组设计资料的t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，两组间比较使用Wilcoxon秩和检验。计数资料以频数或百分比表示，采用χ2检验进行两组间比较。用χ2分析进行Hardy-Weinberg平衡检验。所有因素先进行单因素分析，为避免重要变量的遗漏，将单因素分析中P<0.20的协变量纳入多因素logistic回归分析，逐步向前回归分析与NODAT的独立危险因素，并估算各相关因素的OR值及其95%置信区间(CI)。绘制ROC曲线并计算ROC曲线下面积(area under ROC curve，AUROC)以评价NODAT预测模型的效能。所有检验双侧P值，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1患者一般情况 本研究共纳入心脏移植受者101例，其中NODAT 31例(30.7%)。随访中位时间456 d，四分位数间距(95，785) d，NODAT 3个月，6个月和1年发病率分别为24.8%，25.7%和29.7%。患者基本资料见表1，NODAT组患者年龄(t=-2.47，P=0.016)和BMI(t=-2.09，P=0.043)显著高于非NODAT组。其余各项指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2他克莫司血药浓度与NODAT的关系 结果见图1。NODAT组他克莫司C0/D显著高于非NODAT组(中位浓度 139.3和96.0，P=0.025，WilcoxonW检验统计量=1898.0)。

2.3基因型与NODAT的关系 基因位点、最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)和Hardy-Weinberg平衡检验结果表2。四个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。本次研究人群的四个SNPs 位点的MAF与已报道的东亚人群的MAF相近。在研究的4个SNPs位点中，仅NR1I2 rs2276706基因型与NODAT相关，携带G等位基因的患者发生NODAT的比例显著高于携带A等位基因患者(37.1% 和16.1%，χ2=4.46，P=0.038)，结果见表3。

2.4NODAT的影响因素及风险预测模型 为进一步考察NODAT的影响因素，本研究先对所有因素进行单因素分析，再对P<0.20的因素进行多因素logistic回归分析。单因素分析结果显示移植时年龄≥45岁、BMI≥25 kg·(m2)-1、高血压、高脂血症、他克莫司[C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]和NR1I2基因型的P<0.20。将以上变量纳入多因素logistic回归模型，结果显示他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)[OR=4.52，95%CI(1.63，12.53)，P=0.004]、年龄≥45岁[OR=4.99，95%CI(1.65，15.10)，P=0.005]和BMI≥25 kg·(m2)-1[OR=3.70，95%CI(1.38，9.93)，P=0.009]是NODAT的独立危险因素(表4)。基于以上危险因素构建出2个NODAT的临床预测模型，并绘制出临床预测模型的ROC曲线(图2)。风险预测模型1纳入移植时年龄≥45岁和BMI≥25 kg·(m2)-1两种危险因素，AUROC为0.738(P<0.001)；风险预测模型2在风险预测模型1的基础上纳入他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)，AUROC提高到0.788(P<0.001)。

表1 两组患者基本资料比较

图1 他克莫司血药浓度与NODAT的关系

表2 SNPs位点的分布

3 讨论

他克莫司血药浓度与NODAT的关系尚存争议，本文探究他克莫司血药浓度与心脏移植术后NODAT的关系，结果显示NODAT患者他克莫司浓度显著高于非NODAT患者，这与国内外的相关研究结果一致[12-15]。

表3 4个SNPs位点与NODAT的关系

表4 NODAT的独立危险因素

图2 NODAT风险预测模型的ROC曲线

目前，很多研究关注用于判断NODAT发生风险的他克莫司血药浓度值，但尚未得出一致结论。DCASTEDAL等[12]研究发现他克莫司的致糖尿病作用是剂量依赖性的，浓度高于10 ng·mL-1可增加糖尿病的风险。而另一项研究发现浓度>15 ng·mL-1是新发糖尿病的危险因素[16]。本文使用他克莫司C0/D排除给药剂量、患者体质量等因素对浓度的影响，首次报道他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1per mg·kg-1·d-1可显著增加NODAT发生的风险。

除了他克莫司血药浓度，本文还发现NODAT的其他危险因素有患者的年龄(≥45岁)和BMI[≥25 kg·(m2)-1]。KIM等[3]对391例心脏移植受者的研究也表明年龄>45岁可增加NODAT发生的风险。SHAH等[17]研究发现，从21岁开始，移植受者的年龄每增加10岁，NODAT的风险增加29%。NODAT的风险随着年龄增长而增加，可能与年龄增长导致胰岛β细胞的功能逐渐减退相关[14，18]。BMI≥25 kg·(m2)-1是心脏移植术后NODAT发生的另一个危险因素，这与国外相关研究结果一致[2]。同时，已经有研究证实包括控制体质量在内的生活方式干预能够有效治疗NODAT[19]。高BMI导致NODAT的机制可能与肥胖导致2型糖尿病的机制类似[20]。值得注意的是，本文进一步评估他克莫司血药浓度对NODAT的风险预测能力，结果发现，他克莫司C0/D[≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]可显著改善NODAT风险预测模型的预测效能。

NR1I2基因型在单因素分析中与NODAT相关，但多因素logistic回归分析结果未得出一致结论。NR1I2编码的PXR是调节他克莫司代谢酶(如CYP3A4和CYP3A5)表达的关键转录因子[21]，其可能通过影响他克莫司血药浓度而在单因素分析结果中表现为与NODAT相关。KCNQ1和KCNJ11均为2型糖尿病的易感基因，两者也被发现与NODAT相关[22-23]。CRTC2调节糖代谢并且与肾移植术后NODAT的发生相关[24]。然而，本研究结果显示KCNQ1rs2237895、KCNJ11rs5215和CRTC2rs8450位点的基因多态性与心脏移植术后NODAT无关，可能的原因是样本量较小，因此，未来需要更大样本的研究进一步探讨基因多态性与NODAT的关系。

综上所述，他克莫司C0/D[≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]、年龄(≥45岁)和BMI[≥25 kg·(m2)-1]是心脏移植术后发生NODAT的独立危险因素。基于以上危险因素建立的NODAT风险预测模型具有较好的预测能力。该模型中3个危险因素均为易收集的临床资料，可便捷初步筛选出NODAT高危人群，以便及时干预。本研究样本量小，需要开展更大样本的研究验证当前结果。在未来，需开展前瞻性、大样本、多中心的研究以探讨更多与NODAT相关的因素。