线粒体tRNATyrA5834G突变与Leber遗传性视神经病变的相关性

胡翠芳，孔万仲，陈孟权，梁敏，管敏鑫

（1.温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一种线粒体遗传性视神经疾病，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致双眼同时或先后出现无痛性视力减退，视网膜神经节细胞退行性病变，同时可伴有中心视野缺失及色觉障碍[1-2]，发病人群多为青壮年男性，发病年龄多见于17～30岁。研究表明LHON家系中50%以上由ND1 G3460A、ND4 G11778A和ND6 T14484C这3个原发突变位点引起[3-4]。近年来，除上述3 个原发性突变位点外，相继发现线粒体ND1T3394C、ND1T3866C、tRNAMetA4435G、 ND4G11696A、ND6T14502C、tRNAGluA14693G、tRNAThrA15951G等突变也可能与LHON的致病相 关[5-14]。本研究主要对2个典型LHON患者及其家系进行详细眼科相关检查、线粒体全基因组分析、种系发生学分析及单体型分析，为进一步阐明LHON的发病机制提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 对来自浙江温州地区2个典型LHON家系进行家系调查，编号WZ1007和WZ1035，如图1所示。对2个先证者及家系成员进一步询问，并进行详细的眼科相关检查，完善相关临床病史资料。同时选取104例汉族健康受试者作为正常对照，采集先证者家系和正常对照人群的EDTA-K2抗凝静脉血 5 mL。本研究经温州医科大学伦理委员会批准，所有参与对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 眼科学检查：对2个家系的先证者及其家系中其他成员进行临床眼科检查，包括标准对数视力表检测视力、眼底照相拍片（美国VOLK D90）、俞自萍色觉图检查、电生理仪检测视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）、眼科光学相干断层扫描技术（OCT检查仪，德国Heidelberg公司）等检查。双眼视力损伤程度参照WHO标准，正常＞0.3；0.1≤轻度＜0.3；0.05≤中度＜0.1；0.02≤重度＜0.05；极重度＜0.02。

1.2.2 基因组DNA提取：使用外周血DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），提取2个家系先证者及成员和104例正常对照的EDTA-K2抗凝静脉血的全基因组DNA，NanoDrop1000测定浓度，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增及测序分析：以先证者及家系成员和正常对照的基因组DNA为模板，针对G11778A、G3460A和T14484C这3个原发突变位点所在基因片段进行引物设计，经PCR扩增及产物纯化后，用自动测序仪进行测序[15]。同时，采用二代测序法对先证者及家系成员和正常对照的线粒体基因组进行全序列测序，进一步确定线粒体基因组的突变位点，使用Snapgene等软件对测序结果与剑桥参考序列[16-17]进行比对分析。

1.2.4 种系发生学分析和单体型分析：根据 GenBank选取人（Homo sapiens）、牛（Bostaurus）、小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）等17 个不同物种，对线粒体序列进行种系发生学分析，计算mtDNA突变的保守系数，进行保守性分 析[1]。根据东亚线粒体单体型进化树对线粒体DNA突变的多态性位点进行单体型分型。

2 结果

2.1 临床资料 2个LHON家系图见图1。WZ1007家系先证者（III-2）17岁时因双眼视力同时下降就诊，经检查双眼视力轻度损失，色觉正常；视野检查提示视野中心出现暗点；眼底拍照如图2所示，表现为双眼视盘偏淡，视乳头周围毛细血管轻微扩张；VEP检查表现为P100峰潜时延长，幅值下降；OCT检查无明显变化（见图3）。WZ1035家系先证者（III-2）20岁时因视力骤降就诊，双眼视力中度损失，色觉正常；视野检查提示双眼视野呈现向心性缩小，中心出现暗点；眼底拍照提示杯盘比增大；VEP检查表现为P100峰潜时延长，幅值下降；OCT检查提示鼻侧和颞侧象限视网膜神经纤维层（retinal nerve fiber layer，RNFL）变薄；其母视力重度损失，但未作其他眼科相关检查。2个先证者经临床检查均未发现其他疾病，无其他不良嗜好和外伤史。除WZ1035-II-4外，2个家系其他成员视力均正常。

图1 2个LHON家系图

2.2 线粒体基因组分析 PCR和测序分析结果显示2个家系所有成员和正常对照均未发现G3460A、G11778A和T14484C这3个原发突变位点。通过二代测序法对2个先证者进行线粒体全序列分析，结果如表1所示，2个先证者携带36个线粒体基因突变位点，分别位于D-loop区7个，12S rRNA 2个，16S rRNA2个，tRNA 1个，蛋白编码区24个，包含10个错义突变和14个同义突变，其中10个错义突变为：ND1基因G4084A（Val260Leu），MT-ND2基因G5460A（Ala331Thr），MT-CO2基因G7853A（Val90Ile），ATP6基因A8701G（Thr59AlaA）和A8860G（Thr112Ala）， MT-ND3基因A10398G（Thr114Ala），MT-ND4基因G11696A（Val313Ile），MT-ND5基因T12811C（Tyr159His），MT-Cytb基因C14766T（Thr7Ile）和A15326G（Thr194Ala），其中ND4 G11696A已报道是与LHON相关的线粒体突变位点，其余变异位点通过对人、牛、小鼠、非洲爪蟾4个不同物种进行保守性分析，发现2个先证者同时携带的变异位点中A5834G和T12811C变异位点在进化上保守，通过进一步对17个不同物种mtDNA进行保守性分析，发现A5834G保守系数为87.5%（见图4），除T12811C在正常人突变频率较高外，其余变异位点均不保守，且均已报道可能与LHON的发病无关。同时2个家系中其他母系成员均携带A5834G突变，而104例正常对照和家系中非母系成员则不携带A5834G突变。根据东亚线粒体单体型系统进化树分析，这2个家系的mtDNA序列均属于东亚单体型M7b，已有研究证实M7b会加重LHON的临床表现[18]。

图2 2例先证者的眼底表现

图3 2例先证者的OCT检查结果

3 讨论

本研究中2 个家系的先证者均具有典型LHON 临床表现，2个先证者年龄分别为17岁和20岁，符合LHON好发于青壮年特点，除表现为视力损害外，未发现其他明显临床表现，所有研究对象经PCR扩增测序均未发现G11778A、G3460A和T14484C这3个原发突变位点。本研究对这2个家系进行详细的临床评估及分子遗传学特征分析，通过对线粒体基因组全序列分析，发现这2个家系母系成员均携带tRNATyrA5834G突变位点，该突变影响mtDNA tRNATyr基因T-茎中的第65 位碱基，如图5 所示线粒体tRNATyr的二级结构示意图，T-茎可作为线粒体DNA重链和轻链的启动子，编码多种对tRNA结构稳定性起重要作用的功能蛋白[19]。tRNA作为翻译核心角色，在核酸信息水平和蛋白质功能水平间发挥重要作用，具有高度保守的二级和三级结构[20]，tRNA转录后修饰的密度在所有RNA中最高，主要集中在反密码子环和tRNA核心区域，从标记有tRNA修饰数据的酿酒酵母（S.cerevisiae）tRNATyr晶体结构可知（见图6），其中标记红色的D-loop和T-loop两个主要区域的碱基通过彼此间相互作用来稳定第三折叠结构，这些修饰位点的改变可能会导致tRNA结构发生较大的重排或局部微调[20-21]。目前已有报道证明参与编码tRNA且位于tRNA T茎环处的A14692G、A14693G、C12191T突变位点是LHON相关的线粒体突变位点[22-23]。线粒体G5834A突变可能会影响tRNATyr前体的合成和加工过程，引起tRNATyr的空间结构和功能稳定性改变，tRNA转运代谢功能障碍，线粒体相关蛋白合成和代谢功能障碍，ATP生成减少等一系列反应，最终导致高能量需求的视网膜视神经发生病变，引发LHON。

表1 2个先证者线粒体DNA全序列突变位点分析

图4 通过cluster程序对不同物种中的线粒体tRNATyr基因进行序列比对显示整个物种中5 834位G核苷酸的保守性

图5 线粒体tRNATyrA5834G的二级结构示意图

图6 含碱基修饰频率的tRNA结构彩图

报道中常用于突变位点致病性的评估标准为：①出现在＜1%的对照中；②进化保护（保守性）；③潜在的结构和功能变更[24]。本研究的正常对照中均未发现携带tRNATyrA5834G突变位点，该突变位点在17种生物中高度保守，且可能存在结构和功能的改变，符合线粒体突变的致病标准。同时，已有研究证实线粒体单体型与LHON的外显率和致病性严重程度相关，HUDSON等[25]研究表明线粒体单体型J是欧洲LHON家系的遗传易感型，YU等[26]发现单体型F存在T14484C突变加重LHON严重程度的现象，表明某些单体型可对LHON起有害或保护作用，JI等[27]在中国人群中发现M7b2单体型可增加携带有G11778A家系的患病风险，本研究中2个先证者均属于东亚M7b单体型，提示携带A5834G的M7b单体型可能对LHON临床表型存在影响。2个先证者均具有典型LHON临床表现，2个先证者发病年龄分别为17岁和20岁，平均18.5岁，与冀延春等[28]报道的T12338C突变、QU等[29]报道的T14484C突变以及ZHOU等[30]报道的G11696A突变LHON家系（平均18.5岁、18.4岁）接近，也符合LHON好发于20岁左右青壮年这一特点，A5834G突变的这2个家系外显率分别为8.3%、7.7%，与已经报道的G11778A、G3460A、T14484C这3个原发性突变位点的家系类似，且与T12338C、A14693G、T3394C突变的家系外显率相近，这表明线粒体tRNATyrA5834G突变可能在LHON中发挥协同作用，是与LHON相关的mtDNA突变位点，同时低外显率提示可能存在其他因素（核修饰基因、环境等）影响这2个家系的表型表达。