GLP-1对AD神经元PI3K-AKT-GSK3β通路调节作用研究

李晶鑫 魏亚芬 殷萍

【摘 要】目的：探讨胰高血糖素样多肽-1（Glucagon like polypeptide -1，GLP-1）对阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）神经元磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）- 蛋白激酶B（AKT）- 糖原合成酶激酶 3（GSK3β）通路调节作用。方法：以Aβ25-35孵育神经元细胞系PC12细胞制备的AD细胞模型为研究对象，分为3组：空白对照组、Aβ组和Aβ+GLP-1组.使用MTT法检测各组细胞存活率，Western blot 方法检测各组细胞PI3K-AKT-GSK3β表达水平。结果：与空白对照组相比，Aβ组细胞存活率明显降低（P<0.05）;与Aβ组相比，Aβ+GLP-1组细胞存活率明显升高（P<0.05）。Aβ组PI3K、AKT表达水平明显低于空白对照组，GSK3β表达水平高于空白对照组（P<0.05）;Aβ+GLP-1组PI3K、AKT表达水平明显高于Aβ组，GSK3β表达水平低于Aβ组（P<0.05）。结论：GLP-1通过调节PI3K-AKT-GSK3β的表达水平改善AD细胞模型存活率。

【关键词】胰高血糖素样多肽-1;阿尔茨海默病;神经元

【中图分类号】R749.16【文献标识码】B【文章编号】1002-8714（2020）09-0124-01

AD是目前生活中常见的中枢神经系统慢性进展性的退行性疾病，临床上常见表现为进行性的记忆功能减退和认知功能障碍[1]。胰高血糖素样多肽一1（Glucagon-1ike peptide-1，GLP-1）可通过与GLP-1受体的介导实现对神经元的保护作用[2]。GLP-1是由肠粘膜内分泌细胞以及脑神经细胞中产生的一种多肽类激素，可以通过一种特异的肽转运体经血液循环进入大脑[3]。本文旨在分析GLP-1对AD神经元PI3K-AKT-GSK3β通路调节作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1一般资料

以Aβ25-35孵育神经元细胞系PC12细胞制备的AD细胞模型为研究对象，分为3组：空白对照组、Aβ组和Aβ+GLP-1组.

1.2方法

实验分组：空白对照组、Aβ 组、Aβ+GLP-1组。Aβ的浓度均为 20 μmol/，Aβ+GLP-1组：先加Aβ孵育 1 h 后再加GLP-1，GLP-1浓度为20 μmol/L。使用MTT法检测各组细胞的存活率，Western-Blot法检测各组PI3K-AKT-GSK3β的表达。

1.3观察指标

MTT比色法检测细胞存活率：取各组细胞，去除细胞消化液，加入细胞培养液5ml，吹打成悬液后，离心1500r/m2min，弃上清，再使用同种培养液吹打调节细胞浓度至1×105/ml，接种在96孔板100μL/孔，放置在CO2培养箱内24h。然后每孔加入20μlMTT继续培养4h，之后取上清，每孔加入150μlDMSO，剧烈摇晃10min，溶解结晶。上酶标仪取波长为，比色记录结果。细胞存活率=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）

Western-Blot检测：在实验设计终止的时间点收集样本，裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度。利用聚丙烯酰胺-凝胶电泳根据蛋白的分子量分离蛋白：将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，一抗4℃孵育过夜;第二天充分洗涤后二抗室温孵育1h;最后加ECL反应液后曝光。确定特异性蛋白条带后用Image J软件定量检测条带的灰度值。

1.4统计学分析

用spss19.0软件包进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示（-x±s），组间比较采用F检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1各组细胞存活率的对比：与空白对照组相比，Aβ组细胞存活率明显降低（P<0.05）;Aβ+GLP-1组细胞存活率明显高于空白对照组和Aβ组（P<0.05）。（详见表1）

3 讨论

PI3K-AKT-GSK3β通路由PI3K、AKT及GSK3β三部分组成，是神经系统里重要的信号通路，参与神经元极性、神经系统稳态维持和神经元凋亡等，具有多种关键的调控作用。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，可调节细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能。AKT作为PI3K的下游蛋白分子，在代谢葡萄糖和细胞增殖、转录及凋亡中起到重要作用。GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于体内真核细胞中，与众多蛋白结构蛋白和转录因子相作用，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。在相关研究中发现，AD患者神经元PI3K-AKT表达水平明显降低，GSK3β升高。

GLP-1是一种氨基酸组成的内源性胰岛素样肠肽，可调节血糖，相关研究显示，GLP-1可起到保护神经和抑制老年斑生成的作用，这提示GLP-1在防治AD方面有积极作用。本研究应用GLP-1对AD细胞和动物模型进行干预，观察GLP-1的神经保护作用及对PI3K-AKT-GSK3β信号转导通路的影响。有相关文献显示，GLP-1及其衍生物已被证实具有神经保护作用，且能改善AD模型的记忆和认知功能。但GLP-1是否通过PI3K-AKT-GSK3β通路发挥神经保护作用有待研究。

从本文研究结果发现：① GLP-1可以改善AD细胞模型存活率。②与正常对照组相比，Aβ可使PI3K、AKT表达降低，GSK3β表達升高。③GLP-1可以逆转Aβ引起的PI3K、AKT表达降低、GSK3β表达升高。以上结果提示GLP-1通过调节PI3K-AKT-GSK3β的表达水平改善AD细胞模型存活率。

参考文献

[1] 曾高峰， 宗少晖， 傅松文，等. PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在6-姜酚保护PC12细胞对抗β淀粉样蛋白诱导细胞凋亡的作用[J]. 天然产物研究与开发， 2015， v.27（11）：25-28.

[2] 吴爱兵， 黎明春， 麦宗炯，等. CK2α通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调控肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移[J]. 中国肺癌杂志， 2017， 020（004）：233-238.