miR-135a和miR-146a在阿尔茨海默病患者中的表达及诊断效能评价

薛玉峰 叶丽君 傅攀

[摘要] 目的 探讨miR-135a和miR-146a在阿尔茨海默病（AD）患者中的表达及临床意义，为AD的诊断提供依据。 方法 选取2017年6月—2019年5月浙江省台州市第一人民医院（以下简称“我院”）神经内科住院的65例AD患者为AD组，另选取同期在我院体检的30名健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测miR-135a和miR-146a表达水平，受试者工作特征（ROC）曲线评价miR-135a和miR-146a对AD诊断效能。 结果 AD组miR-135a表达低于对照组，miR-146a表达高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。miR-135a诊断AD的临界值为0.825，敏感度为0.923，特异性为0.700;miR-146a诊断AD的临界值为2.065，敏感度为0.877，特异性为0.900。 结论 AD患者中miR-135a表达下调，miR-146a表达上调，对AD有较高的诊断效能。

[关键词] 阿尔茨海默病;miR-135a;miR-146a;表达

[中图分类号] R749.16          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（b）-0016-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-135a and miR-146a in patients with Alzheimer′s disease （AD）， and to provide evidence for the diagnosis of AD. Methods Sixty-five patients with AD who admitted to Department of Neurology， the First People′s Hospital of Taizhou of Zhejiang Province （“our hospital”for short） from June 2017 to May 2019 were enrolled in AD group. In addition， 30 healthy subjects who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as control group. The expression levels of miR-135a and miR-146a were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and the diagnostic efficacy of miR-135a and miR-146a in AD were evaluated by receiver operating characteristic （ROC） curve. Results The expression of miR-135a in AD group was lower than that in control group， and the expression of miR-146a was higher than that in control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. The cut-off value of miR-135a in the diagnosis of AD was 0.825， the sensitivity was 0.923， and the specificity was 0.700. The cut-off value of miR-146a in the diagnosis of AD was 2.065， the sensitivity was 0.877， and the specificity was 0.900. Conclusion The expression of miR-135a is down-regulated， the expression of miR-146a is up-regulated in AD patients， which have a higher diagnostic efficacy for AD.

[Key words] Alzheimer′s disease; MiR-135a; MiR-146a; Expression

阿爾茨海默病（AD）是一种进行性神经系统退行性疾病，起病隐匿，临床症状通常表现为记忆障碍、失语、失认、执行功能障碍、视空间技能损害及行为和人格改变等的全面性痴呆，病因未明。随着我国人口老龄化越来越严重，AD发病率有增加趋势，给社会带来越来越重的负担，因此，对AD的早期诊疗有重要意义[1]。微小核糖核酸（miRNA）是由18～25个核苷酸组成的内源性非编码RNA，在中枢神经系统中表达，参与调节神经元分化，突触和神经突的可塑性增长，与AD的发病机制有关[2]。本研究旨在探讨miR-135a和miR-146a在AD患者中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月—2019年5月浙江省台州市第一人民医院（以下简称“我院”）神经内科住院的65例AD患者为AD组，同期选取我院30名健康体检者为对照组。

纳入标准：①参考《精神病诊断和统计手册》[3]的诊断标准;②年龄61～90岁;③记忆能力或认知功能下降≥6个月;④受教育年限≥5年。排除标准：①合并严重的心脑血管、肝脏、肾脏等疾病者;②精神病患者;③依从性差者。本研究均经患者及家属知情同意，并签署知情同意书，且本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集  清晨采集受试者空腹外周血4 mL于枸橼酸钠抗凝管内，3000 r/min离心10 min（离心半径80 mm），分离血浆置于-80℃冰箱保存备检。

1.2.2 miR-135a和miR-146a的检测  400 μL患者血浆用RNA提取液（Qiagen公司，USA，批号：157037 881）提取总miRNA，逆转录试剂盒（Qiagen公司，USA，批号：160029569）以25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min为条件逆转录为cDNA。7500型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（ABI公司，USA）进行扩增。miR-135a上游引物5′-GGGTAGAGTTTGTGTGTTG-CC-3′，下游引物：5′-TCTTCTTCCACCTCAGCCAC-3′;miR-146a上游引物：5′-CCGCCGTGAGAACTGAAT-TCCA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;内参GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAG-AAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反应条件：95℃预变性5 min;95℃变性10 s，60℃退火45 s，40个循环;72℃延伸 5 min。采用2-ΔΔCt的方法计算所测血浆标本miR-135a和miR-146a的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验;受试者工作特征（ROC）曲线对诊断效能进行评价。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组性别、年龄、高血压病、糖尿病和教育程度比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性;AD组简易精神状态量表[3]（MMSE）评分低于对照组（P < 0.05）。见表1。

2.2 两组miR-135a和miR-146a表达水平比较

AD组miR-135a表达低于对照组，miR-146a表达高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 miR-135a和miR-146a对AD的诊断效能

miR-135a诊断AD的临界值为0.825，敏感度为0.923，特异性为0.700;miR-146a诊断AD的临界值为2.065，敏感度为0.877，特异性为0.900。见表3，图1。

3 讨论

随着社会的发展、人口老龄化的加快，AD的患病率呈上升趋势。据报道，全世界65岁以上AD患者多达5000万例，并且到2020年将增加到7500万例[4]。miRNA是一类内源性短链非编码核糖核酸，miRNA位于3′非翻译区的特定的互补序列部分，用于调节miRNA的降解和翻译[5-6]。

AD是一种与年龄相关的退行性疾病，主要病理表现为大脑海马区的Aβ在细胞外沉积形成老年斑，而β分泌酶是β-淀粉样蛋白（Aβ）生成的限速酶，tau蛋白的过度磷酸化导致神经细胞内神经元缠结，脑皮质神经细胞减少，新皮层、脑血管改变[7-9]。Aβ作为机体的正常代谢物，可以由淀粉样蛋白前体蛋白（APP）水解得来，但当APP功能出现异常，就会导致Aβ异常沉积，最终造成神经细胞毒性作用[10-11]。同时，AD也有可能由氧化应激和炎症导致[12-13]。miRNA在脑组织中表达丰富，可调节神经元内多种靶基因，对神经系统的发育分化起重要的调节作用。神经系统中miRNA相关蛋白的异常调节与神经退行性疾病（AD、帕金森病等）密切相关[14-15]。miRNA在AD中可能参与以下过程：①参与Aβ、tau蛋白病理相关的基因表达水平调控;②神经元的代谢与凋亡;③记忆功能减退。因此，miRNA有可能成为AD诊断的标志物和治疗新靶点[16-17]。

miR-135a是miR-135家族的重要成员之一，具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的功能，其在肝癌、前列腺癌和骨肉瘤等多种肿瘤的发生、发展中发挥了重要的调控作用[18-20]。陈李芳等[21]报道miR-135a在AD组患者血清中表达显著低于对照组，miR-135a有望成为AD早期诊断的生物标志物。本研究结果显示，AD组miR-135a表达量低于对照组（P < 0.05），与刘辰庚等[22]结果一致。miR-146a是κ基因结合核因子（NF-κB）的依赖性基因，并且通过抑制人类单核细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和白细胞介素1受体相关激酶1（IRAK1）下调NF-κB的表达，在固有免疫、炎症反应、细胞分化、癌症发生等生物学过程中均发挥重要作用[23]。miR-146a可以直接靶向补体因子H（CFH），β-APP相关的蛋白和IRAK-1导致AD大脑炎症反应增加，miR-146a的水平与AD大脑中的老年斑密度和突触病理呈正相关[24]。AD的发生与免疫功能紊乱密切相关，AD患者海马和额叶皮质中miR-146a表达显著上调，核转录因子可诱导其表达，CFH是脑组织内重要的具有免疫抑制功能的因子，而增高的miR-146a能抑制CFH表达，导致AD患者神经元持续炎症反应[25]。有学者认为，载脂蛋白E基因等位基因e4（apoE4）是AD的普遍遗传危险因素[26]。Arena等[27]在AD的海马中发现miR-146a表达增加，并且与其目标IRAK-1呈负相关，miR-146a可能参与大脑发育和神经变性。本研究结果显示，miR-146a在AD患者外周血中表达显著上调，曲线下面积为0.921，具有较高的診断效能。

综上所述，miR-135a在AD患者外周血中表达的下调，miR-146a表达上调，对AD的诊断有一定的应用价值。

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（收稿日期：2020-01-07）